......... Elektronová mikroskopie pro biology .........
© 2001 < Jana Nebesářová >
........Kapitola 3.5 - Pozorování a záznam obrazu 

Obsah:

Trocha historie...
Proč elektrony?
Transmisní
     elektronový
     mikroskop (TEM)
Příprava preparátů
     pro TEM chemickou
     cestou
Příprava preprátů
     pro TEM fyzikálními
     metodami
Další metody přípravy
     prepárátů pro TEM
Skanovací elektronový
     mikroskop (SEM)
Příprava preparátů
     pro SEM
Počítače a elektronová
     mikroskopie
Protokoly
Literatura
Autoři
Odkazy
Hl. stránka
Zavřít

Pozorování a záznam obrazu

Praktickým výstupem z transmisního elektronového mikroskopu je trvalý záznam pozorovaného obrazu. V současnosti se obraz zaznamenává buď na speciální fotografický materiál nebo v digitální podobě pomocí CCD kamer.
Fotografický záznam obrazu je tradičním způsobem jeho zachycení. V TEM je pod stínítkem umístěna fotografická komora, ve které je uložena zásoba fotografických filmů uložených do speciálních zásobníků a pouzder (obr. 1), (obr. 2), které usnadňují manipulaci s nimi např.při vkládání do mikroskopu a při jejich expozici. Při fotografickém záznamu dojde k odklonění stínítka, najetí pouzdra s filmem a k dopadu elektronů na jeho povrch. Negativní fotografický materiál vhodný pro TEM je tvořený polyesterovou podložkou,která je stabilní ve vakuu a na které je nanesena želatinová vrstvička s drobnými krystalky nejčastěji chloridu stříbrného. Po expozici zářením dojde k jejich transformaci a k vytvoření latentního obrazu. Po vyvolání exponovaná místa zčernají, přičemž míra zčernání závisí na intenzitě osvětlení. Na rozdíl od klasické černobílé fotografie v TEM exponuje film dopad elektronů, které se energeticky výrazně odlišují od fotonů. Proto je třeba používat speciální fotografické materiály s citlivostí posunutou do oblasti velmi krátkých vln a také materiály, které vydrží vysoké vakuum v mikroskopu.
Fotografický materiál je charakterizován řadou parametrů. Jedním z nich je citlivost, která udává závislost zčernání na intenzitě osvětlení. Pro aplikaci v TEM je snaha posunout citlivost fotografického materiálu do oblasti velmi krátkých vln. Navíc sníženou citlivost materiálu k dopadu velmi krátkého vlnění elektronů kompenzuje zčásti jejich vysoká energie. Zvýšení citlivosti obvykle vede k nárůstu zrnitosti fotografického materiálu. Zrnem se rozumí shluky krystalů, které po vyvolání celé zčernají. U kvalitního fotografického materiálu je snaha o co nejjemnější zrnitost, která umožňuje dosáhnout vysoké rozlišení. Výslednou velikost zrna je možné ovlivnit i kvalitou vyvolávacího procesu, např. teplotou vývojky, prodlužováním vyvolávacího času (obr. 3). Při správném zpracování negativu může být zrno pozorovatelné až při 6-8 násobném zvětšení. Rozlišovací schopnost vyjadřuje počet bodů nebo čar, které je možné rozeznat po vyvolání daného fotografického materiálu v určité oblasti. Pro TEM se používají materiály s rozlišovací schopností od 100 čar/mm výše. Dalším parametrem negativního materiálu je gradační křivka (obr. 4), která udává změnu zčernání v závislosti od změny intenzity osvitu. Pro záznam obrazu v TEM volíme většinou materiál se strmější gradační křivkou, aby i malá změna osvitu výrazně změnila stupeň zčernání fotografického materiálu, neboť biologické preparáty jsou většinou málo kontrastní. Strmost lze také ovlivnit volbou vývojky a dobou vyvolávání. Dalším požadavkem na fotografický materiál je expoziční pružnost. To znamená, že fotografický materiál musí být schopný reprodukovat celou škálu exponovaných odstínů i při výrazném, několikanásobném přeexponování. I když současné přístroje umožňují měřit intenzitu osvitu stínítka, přesto může lehce dojít k přeexponování snímku. A protože získaný negativ je výsledkem dlouhé práce, je i v tomto případě nutné získat kvalitní fotografii. Devět z deseti zkušených mikroskopiků doporučuje nasnímat vzácné snímky vícekrát při různých expozičních podmínkách a po vyvolání z nich vybrat nejlepší. Důležitým požadavkem je, aby byly planfilmy stabilní ve vakuu a nezhoršovaly jej. Protože se většinou skladují v lednici a může dojít k jejich zvlhnutí, je třeba je před vložením do mikroskopu umístit do rotačkového vakua, aby došlo k jejich vysušení a odplynění (obr. 5). Dodavateli fotografických planfilmů pro účely transmisní elektronové mikroskopie jsou firmy Agfa, Kodak a Ilford (obr. 6).
V posledním desetiletí se objevila nová možnost záznamu obrazu, která pravděpodobně v nejbližší době zcela nahradí klasický fotografický záznam. Jde o přímý přenos obrazu v digitální podobě na obrazovku monitoru počítače a dále jeho uložení do paměti nebo na CD-rom apod. Aby mohlo k tomuto přenosu dojít, je třeba do dráhy elektronového svazku v oblasti pozorování obrazu vložit detektor, který zaznamená množství primárních elektronů a jejich energii v závislosti na místě dopadu. Ideální detektor elektronů by měl být schopen detekovat elektronový obraz bez degradace jeho rozlišení a přidání šumu, měl by mít velký počet pixelů, široký dynamický rozsah a výbornou linearitu. Detektor by měl zaznamenat obraz během několika vteřin a tento obraz by měl být okamžitě k dispozici v počítači k dalšímu zpracování a analýze. Nejblíže k těmto požadavkům má slow scan CCD kamera, která se dnes již stala standardním vybavením moderních transmisních elektronových mikroskopů.
CCD senzor byl vynalezen v sedmdesátých letech. V elektronové transmisní mikroskopii byl poprvé použit v roce 1986 Mochelem a Mochelem , kteří konvertovali elektronový obraz na světelný pomocí scintilátoru. Ten dále přenesli prostřednictvím čoček a zrcadel na CCD kameru Photometrics, 576x384. V současné době jsou slow- scan CCD kamery (SSC) komerčně dostupné a ke konverzi elektronů na fotony se v nich používá nejčastěji YAG krystal, na který dopadají primární elektrony. Vzniklý obraz se přenáší na CCD senzor pomocí vláknové optiky, která zaručuje vysokou účinnost přenosu (obr. 7). CCD senzor je tvořen tisíci až milióny pixelů, které si můžeme představit jako jednotlivé elektricky izolované buňky schopné akumulovat náboj úměrně intensitě dopadajícího svazku. Po přečtení vystupuje ze CCD čipu analogový signál, který se digitalizuje 12 bitovým A/D převodníkem.
K dalším výhodám SSC kamer patří velký rozměr pixelů, nejčastěji 24x 24 µm, což umožňuje zachytit více elektronů, zvýšit tak dynamický rozsah kamery a udržet dobré rozlišení obrazu. Celá plocha čipu je využita k detekci obrazu, takže kamera nemůže pracovat v TV režimu. K potlačení šumu se SSC kamery chladí buď pomocí kapalného dusíku nebo Peltiérovými články a přispívá k němu i nízká čtecí rychlost.
Celkově lze shrnout, že SSC kamery převyšují fotografický film v dynamickém rozsahu, v linearitě, citlivosti a granularitě, která na rozdíl od filmového záznamu, kde je hlavním zdrojem šumu, u záznamu SSC kamerou prakticky neexistuje. Na druhé straně jsou horší v rozlišení a poskytují menší počet rozlišitelných pixelů než film (2000x2000 u SSC ku 20000x20000 u filmu za předpokladu rozlišení u filmu 5 µm a plochy filmu 10x10 cm). Z uvedeného je zřejmé, že SSC kamera v některých směrech výrazně převyšuje filmový záznam, např. v případě záznamu elektronových difraktogramů, kde je schopna rozlišit mnohonásobně více stupňů šedi než film. Z toho vyplývají i hlavní oblasti použití SSC kamer v transmisní elektronové mikroskopii, jako jsou on-line holografické rekonstrukce, 3D rekonstrukce, detekce elektronových difraktogramů a obrazů pořízených v low-dose režimu při prohlížení velmi citlivých preparátů, např. kryořezů, transmisní elektronové mikroskopii vysokého rozlišení, elektronové spektroskopii apod. Obrovskou předností SSC záznamu je možnost vyhnout se mokrému fotografickému procesu, který je pracný, časově i finančně náročný. To je hlavní důvod rychlého rozšíření SSC kamer v transmisní elektronové mikroskopii k záznamu obrazu i v nejběžnějších biologických aplikacích. Na (obr. 8) a (obr. 9) je porovnání kvality obrazu nasnímaného TV CCD kamerou a SSC kamerou.


 Předchozí Další  

Literatura

Obrázky

Obr.1 - Zásobníky planfilmů TEM JEOL 1010
Zpět
obr.2 - Uložení planfilmu do kovového držáku TEM Philips 420
Zpět
Obr.3 - Košík na vyvolávání planfilmů
Zpět
Obr.4 - gradační křivky: 1- kontrastního, 2- normálního, 3- měkkého fotografického materiálu, S množství světla, H optická hustota fotomateriálu po vyvolání
Zpět
Obr.5 - Sušička planfilmů TEM JEOL 1010
Zpět
Obr.6 - Planfilmy pro TEM od různých dodavatelů
Zpět
Obr.7 - Schema SSC kamery BioScan Gatan
Zpět
Obr.8 - Digitální záznam obrazu z TV CCD kamery Lhesa, A-průměr z 5 obrazů, B-průměr ze 100 obrazů, C-po úpravě jasu a kontrastu
Zpět
Obr.9 - Digitální záznam obrazu z SSC kamery BioScan
Zpět

       Desing by NebeNet © 2001 < Jana Nebesářová >