Obsah:
Trocha historie...
Proč elektrony?| Metoda negativního kontrastu Je určena pro pozorování vzorků jejichž velikost je hluboko pod tloušťkou ultratenkých řezů, např. různých biologických makromolekul (proteinů, lipoproteinů, polysacharidů, nukleoproteinových komplexů), isolovaných buněčných organel (mitochondrie, membránové systémy) a celých buněk (bakterie, viry). Princip metody spočívá v zachycení vzorku na podložní fólii nataženou na síťce a jeho zalití barvivem, které obsahuje těžký kov. Barvivo obklopí vzorek a vytvoří temné pozadí, v němž se jednotlivé objekty jeví jako světlé díky menší schopnosti rozptylovat primární elektrony. Barvivo přitom pronikne do povrchových nerovností objektu, což umožňuje jejich pozorování. Odtud název metody negativní kontrast. Velkou předností metody je její jednoduchost a rychlost. V nejjednodušším provedení se kapka např. virové suspenze smíchá s barvivem a směs se nanese na síťku potaženou formvarovou blánou. Po odsátí přebytečné tekutina a po zaschnutí se vytvoří na bláně tenký film s částicemi obalenými barvivem. Aby se odstranily deformace preparátu, které by mohly vzniknout ve fázi sušení, je často nezbytné stabilizovat ho před barvením rychlou, několik vteřin až několik minut trvající fixací pufrovaným roztokem GA. V případě, že vzorek obsahoval vyšší koncentraci solí nebo cukrů, je vhodné před fixační proceduru zařadit jeden či dva mycí kroky. U vzorků, které obsahují částice různé hmotnosti, velikosti nebo složení, se doporučuje použít k jejich nanesení na síťku s blánou atomizer. Stejný postup se doporučuje při prohlížení velmi malých objektů, které by v případě klasické kapkové metody zalilo příliš velké množství barviva a byly by v něm těžko rozpoznatelné. Další sofistikovanější způsob provedení metody negativního kontrastu ukazuje schéma na (obr. 1), kde se částice přichytí na uhlíkovou blánu, zčásti oddělenou od slídové podložky. Výhodou tohoto postupu je, že preparát během celé procedury nevyschne. Optimální znázornění pozorovaných částic vyžaduje správný poměr mezi koncentrací barviva a hledaných objektů, minimální interakci mezi nimi a dokonalou disperzi barviva i částic na povrchu síťky. Proto i přes zdánlivou jednoduchost metoda vyžaduje jisté zkušenosti a do jisté míry i štěstí. Co se koncentrace pozorovaných objektů týká, udává se u virové suspenze jako optimální koncentrace 10-9 až 10-12 částic v 1 ml. Kontrastující činidlo by kromě jiného mělo být také snadno rozpustné, mělo by být vysoce elektrodenzní, nereagovat se vzorkem a mělo by být stálé při ozáření elektrony. Přehled nejčastěji používaných kontrastujících látek je v tab.1. Z tohoto spektra je nejvíce používaná kyselina fosfowolframová, pro kterou se používá zkratka PTA z anglického názvu "phosphotungstic acid". Výchozí koncentrace vodného roztoku bývá kolem 2% při pH 6,0 až 7,0. Roztok je možné díky velké stálosti dlouho skladovat v lednici. Dalším výborným barvivem je 1 - 2 % vodný roztok octanu uranylu, který patří však do kategorie nestálých roztoků i při skladování ve tmě a chladu a je třeba ho připravit čerstvý těsně před použitím. Jeho další nevýhodou je i skutečnost, že pH roztoku se nemůže zvýšit nad 5,0, neboť při vyšším pH se tvoří sraženiny hydroxidu uranylu. V neposlední řadě se na pozitivním výsledku metody podílí výběr vhodných sítěk potažených podložními fóliemi, které by měly být co nejtenčí, ale přitom pevné a dobře smáčitelné. Pro rutinní práci se obvykle používají síťky potažené pouhlíkovanou formvarovou nebo čistou uhlíkovou fólií. Formvar je polyvinyl formaldehyd, který má schopnost vytvářet po zaschnutí na hladkých površích, např. skla, tenké filmy. K přípravě formvarových blan se používá postup popsaný v protokolu č. a znázorněný na (obr. 2) , kdy tloušťka blány závisí přímo úměrně na koncentraci formvaru v roztoku a dále ji ovlivňuje vytažení skleněné tyče z roztoku (čím rychleji, tím tenčí blána). Vyšší kvalitu představují uhlíkové blány, které je možné připravit i v tloušťkách 3-5 nm. Připravují se nejlépe napařováním uhlíku na slídu v napařovací aparatuře, (obr. 3) a (obr. 4). Do ní se umístí uhlíkové nebo grafitové tyče, z nichž jedna má zúžený konec. K vytvarování uhlíkových elektrod se používají speciální ořezávátka (obr.8). Upravené konce se o sebe opřou (obr. 5) a při průchodu elektrického proudu v místě zúžení dojde ke zvýšení odporu a v důsledku toho ke zvýšení teploty na hodnotu, při které se z daného místa začne vypařovat uhlík. Celá procedura se provádí po vyčerpání prostoru napařovačky difúzní vývěvou. Vrstvička nanesená na slídě se splaví podobně jako u formvarových blan na vodní hladině. Pro přípravu zvláště homogenního uhlíkového filmu se používá postupu naznačeného na (obr. 6), tzv. nepřímého napařování. Vypařené částice uhlíku jsou odráženy z povrchu mikroskopického podložního skla nastaveného v určitém úhlu k elektrodám a dopadají na čerstvě odštípnutý kousek slídy, zastíněný před přímým dopadem. Nevýhodou obou typů filmů je, že se časem stávají hydrofóbní. Ke zvýšení jejich smáčitelnosti se používá buď vlivu některých chemikálií na jejich povrch nebo se v upravené naprašovací aparatuře vystaví účinku doutnavého výboje. Na (obr. 7) je příklad zobrazení bakteriální suspenze připravené metodou negativního kontrastu. |
 Předchozí |
Další  |
 Literatura | |
Obrázky | |
 |
Obr.1 - Jeden ze způsobu provedení metody negativního kontrastu |
| Zpět | |
 |
Obr.2 - Příprava formvarových blan splavením z podložního skla na vodní hladinu |
| Zpět | |
 |
Obr.3 - Schéma napařovací aparatury |
| Zpět | |
 |
Obr.4 - Napařovací aparatura JEOL JEE 4C |
| Zpět | |
 |
Obr.5 - Úprava hrotů uhlíkových elektrod |
| Zpět | |
 |
Obr.6 - Metoda nepřímého naprašování uhlíkových vrstev |
| Zpět | |
 |
Obr.7 - Metodou negativního kontrastu připravená bakteriální suspenze |
| Zpět | |