Obsah:
Trocha historie...
Proč elektrony?| Kontrastování ultratenkých řezů Biologický materiál zalitý do pryskyřice má skoro stejnou hustotu jako zalévací hmota. Tato skutečnost je příčinou toho, že ultratenké řezy mají v TEM minimální kontrast. Ten je možné zvýšit několika způsoby: - zmenšit objektivovou clonu, což však nezvýší kontrast selektivně (obr. 1) a (obr. 2). - snížením urychlovacího napětí (obr. 3), - zvýšením tloušťky řezu, což však vede k zhoršení chromatické vady a v konečném důsledku k neostrosti výsledného obrazu Dalším způsobem, který se používá nejvíce, je selektivní adsorpce těžkých kovů na buněčné organely. Protože těžké kovy více rozptylují primární elektrony, zvyšují tak kontrast struktur, na které se adsorbovaly. K prvnímu kontrastování vlastně dochází při fixaci OsO4. V ostatních případech se řezy kontrastují buď před zalitím, tzv. v bloku, nebo po nakrájení na ultratenké řezy přímo na síťkách. Kontrastování vzorku v bloku - se provádí buď okamžitě po fixaci nebo při odvodňování. Ke kontrastování se používají 0,5 - 1 % roztoky octanu uranylu nebo kyseliny fosfovolframové. Ve srovnání s kontrastováním ultratenkých řezů nemají vzorky kontrastované v bloku takový kontrast a ostrost. Kontrastování ultratenkých řezů - nejčastěji používaná kontrastovací činidla jsou octan uranylu a citrát olova. Octan uranylu se používá v podobě vodných nebo alkoholických roztoků v koncentraci od 1 % do nasycení (Protokol č.10). Alkoholické roztoky reagují rychleji. Octan uranylu reaguje především s nukleovými kyselinami, ale také s proteiny. Citrát olova zvyšuje obecně kontrast membrán, proteinů, nukleových kyselin a glykogenu. Pokud se ke kontrastování použijí postupně obě látky, vzorek získá rovnoměrný kontrast všech buněčných struktur. Vlastní kontrastování se většinou provádí na hladině kontrastující látky. V prvním kroku se kontrastuje octanem uranylu. Používají se k tomuto účelu Petriho misky s kouskem parafilmu, na který se nakape kontrastující činidlo. Aby roztok neobsahoval precipitáty, je vhodné ho filtrovat jednorázovým filtrem s velikostí ok 0,45 µm nasazeným přímo na injekční stříkačku, ze které roztok kapeme. Kapky v případě alkoholových roztoků děláme co největší (obr. 4), aby v nich nevznikaly sraženiny díky odparu. Navíc je třeba Petriho misku zabalit do hliníkové fólie, protože v přítomnosti světla v roztoku vzniká hnědá sraženina. Na kapky se pinzetou přenesou síťky a po 10-15 min se síťky opláchnout destilovanou vodou pokud použijeme vodný roztok nebo 30% alkoholem, pokud použijeme alkoholový roztok. Ve druhém kroku se kontrastuje roztokem citrátu olova (Protokol č.11), který pro změnu reaguje se vzdušným CO2 za vzniku nerozpustného uhličitanu olovnatého. Proto je třeba při kontrastování minimalizovat kontakt roztoku olova se vzduchem. Do Petriho misky s parafilmem proto přidáváme pár peciček NaOH nebo KOH zalitých vodou (obr. 5), které sníží obsah CO2 v Petriho misce. Roztok se před použitím centrifuguje aspoň 5 min při 15 tisících otáček a odebírá se těsně pod hladinou. Kapky se dělají co nejmenší, opět aby se minimalizoval styk roztoku se vzduchem. Po 10-15 min se síťky důkladně opláchnou destilovanou vodou, osuší a uloží do zásobníku nebo Petriho misky (obr. 6). Pokud se kontrastuje větší množství řezů, je možné zakoupit přístroj pro strojové kontrastování např. od firmy Leica (obr. 7). Jak udává výrobce, výhodou strojového kontrastování je reprodukovatelnost a výsledná čistota řezů. Vzhledem k vyšší spotřebě kontrastujících roztoků se tento způsob u nás zatím příliš nevyužívá. Kontrastování patří mezi velmi časté zdroje artefaktů, právě vzhledem k časté tvorbě precipitátů a to jak v případě uranu, tak olova. O výsledku kontrastování rozhoduje pečlivá příprava roztoků, rychlé přenášení sítěk na kapky, jejich důkladné oplachování po kontrastování a řada dalších detailů. Na závěr této kapitoly je třeba připomenou, že jak soli uranu, tak olova patří mezi jedy, proto je třeba s nimi bezpečně a promyšleně pracovat a použité roztoky ekologicky likvidovat. |
 Předchozí |
Další  |
 Literatura | |
Obrázky | |
 |
Obr.1 - Vliv objektivové clony na výsledný kontrast obrazu - maximální objektivová clona |
| Zpět | |
 |
Obr.2 - Vliv objektivové clony na výsledný kontrast obrazu - minimální objektivová clona |
| Zpět | |
 |
Obr.3 - Závislost kontrastu a rozlišení na urychlovacím napětí |
| Zpět | |
 |
Obr.4 - Kontrastování roztokem octanu uranylu |
| Zpět | |
 |
Obr.5 - Kontrastování roztokem citrátu olova |
| Zpět | |
 |
Obr.6 - Zásobníky pro skladování hotových sítěk |
| Zpět | |
 |
Obr.7 - Zařízení nabízené firmou Leica pro kontrastování ultratenkých řezů |
| Zpět | |