Obsah:
Trocha historie...
Proč elektrony?| Mrazové metody Z fyzikálních postupů se uplatňují především mrazové metody, zatímco mikrovlnné ozáření se používá většinou jen k urychlení jednotlivých kroků přípravy při použití chemické cesty. Velkou předností mrazových metod je rychlost přípravy, zachování povrchové struktury a v případě potřeby i možnost nahlédnout do struktury vnitřních tkání nebo buněk za pomoci mrazového lámání. Kryofixace - stejně jako v přípravě preparátů pro TEM měla by být co nejrychlejší, aby při ní nevznikly krystalky ledu, které by poškodily preparát. Zmrazovat je možné jak předem chemicky fixovaný materiál ošetřený kryoprotektantem, tak materiál čerstvý. Pro mrazení platí stejná pravidla jako v případě TEM, která jsou uvedena v kap.5.1. Mrazové lámání - dovoluje odhalit vnitřní povrchy buněčných organel. Lom se ve zmrazeném materiálu šíří cestou nejmenšího odporu, nejčastěji podél membrán. Samotné lámání je možné provést ve specializované aparatuře, která jako v případě kryoattachmentu Alto 2500 firmy Gatan (obr. 1) je připojena k mikroskopu a po provedení lomu je preparát pokoven. Výhodou tohoto uspořádání je to, že všechny operace jsou prováděny ve vakuu, takže nehrozí zničení odhalených povrchů např. jejich orosením. Na (obr. 2) je příčný lom listem Eucalyptu, připravený zmrazením, zlomený v apartuře Alto, pokovený 3 nm vrstvičkou Pt a Pd a prohlédnutý v SEM JEOL 6700 F. Lámání lze provést i improvizovaně pomocí pinzet pod hladinou kapalného dusíku nebo na vychlazeném kovovém bloku. Velkou výhodou mrazového lámání je fakt, že při něm nedochází k poškození odhalovaného povrchu tlakem žiletky či jiným řezným nástrojem. Mrazové leptání - je metoda, která se používá ke studiu povrchů odhalených při odkrojení zmrazeného preparátu (obr. 3). Spočívá v částečné sublimaci ledu z takto obnaženého povrchu za sníženého tlaku, při které se zvýrazní prohlubně a vakuoly. Po nastínování se preparát prohlíží ve zmrazeném stavu v mikroskopu vybaveném kryodržákem. Mrazové sušení - je často používanou variantou v případě, že mikroskop nemá ve své výbavě kryodržák. Zmrazený preparát se přemístí do vakua a nechá se z něj vysublimovat led. Jak vypadá takto připravený preparát, dokládá (obr. 4) s příčným lomem listu Eucalyptu, který po zlámání v zmrazeném stavu byl vysušen sublimací ledu ve vakuu, pokoven vrstvou Au a prohlédnut v SEM JEOL 6300. Opět lze mrazové sušení provádět v specializovaných aparaturách, kde je možné řídit rychlost sublimace a zajistit tak kvalitní výsledek, nebo improvizovaně např. např. v lyofilizátoru, kde výsledek závisí na odolnosti preparátu a často bývá nereprodukovatelný. |
 Předchozí |
Další  |
 Literatura | |
Obrázky | |
 |
Obr.1 - kryoattachment Alto, který umožňuje lámání zmrazených vzorků a jejich následné pokovení ve vakuu mikroskopu |
| Zpět | |
 |
Obr.2 - příčný lom listem Eucalyptu, připraveno zlomením zmrazeného vzorku v kryoattachmentu Alto, pokovením 3 nm vrstvou slitiny Pt-Pd, prohlíženo ve zmrazeném stavu v SEM JEOL 6700 F |
| Zpět | |
 |
Obr.3 - schematické znázornění metody mrazového leptání: a)řez zmrazeným objektem a sublimace ledu z jeho povrchu, b) schéma membrány: ES - vnější exoplasmatický povrch, PS - vnitřní protoplasmatický povrch, EF - zlomová plocha na exoplasmatické části membrány, PF - zlomová plocha na protoplazmatické části, c) interpretace lomem odkrytých ploch jaderné membrány (jm) a cytoplazmatické membrány (cm) |
| Zpět | |
 |
Obr.4 - příčný lom listem Eucalyptu, po mrazovém lámání byl vzorek vysušen sublimací a pokoven zlatem, prohlíženo v SEM JEOL 6300 |
| Zpět | |