Elektronová mikroskopie pro biology < Jana Nebesářová >

Příprava ultratenkých řezů

Jak bylo zmíněno na začátku kapitoly 4., preparáty pro TEM by měly mít optimálně tloušťku 60 - 70 nm. Dalším krokem přípravy je tedy krájení zalitých preparátů na řezy této tloušťky, které jsou označované jako ultratenké. Obecně platí, že čím tenčí jsou ultratenké řezy, tím lepší je rozlišení struktur v obraze, ale slabší kontrast.
Jsou čtyři výchozí podmínky, ovlivňující celou přípravu ultratenkých řezů, kterým se budeme věnovat v následujících kapitolách:
- kvalitně zpolymerovaný bloček s preparátem
- dobrý nůž
- ultramikrotom, tedy přístroj pro přípravu ultratenkých řezů
- síťka pro manipulaci s ultratenkými řezy

Úprava bločku

Před vlastním krájením je třeba si připravit řeznou plochu, aby měla vhodný tvar a velikost a také odstranit přebytky pryskyřice. Vzhledem k rozdílné tvrdosti zalité tkáně a čisté pryskyřice právě na rozhraní mezi nimi dochází nejčastěji k praskání řezů a jejich vytrhávání. Vzorek v ořezaném bločku by měl být ve vrcholu pyramidy s dostatečně širokou základnou, aby se při řezání neohýbala a nedeformovala. Čelo bločku by mělo mít tvar pravidelného lichoběžníku, aby se při řezání skládaly řezy do pásky, kterou je snadnější nabrat na síťku. Na (obr. 1) je znázorněno postupné seřezávání bločku do optimálního tvaru, které může být prováděno ručně pomocí žiletky nebo strojově pomocí trimovací frézky (obr. 2).
Před vlastním ultratenkým krájením se často připravují polotenké řezy tloušťky 0,5 - 2 µm, které se většinou barví toluidinovou modří (Protokol č.9). Po kontrole na světelném mikroskopu se ze vzorku vybere místo, které je zajímavé a ze kterého se budou krájet ultratenké řezy.

Nože pro ultratenké krájení

Na krájení ultratenkých řezů se používají skleněné nebo diamantové nože (obr. 3). Zatímco skleněné nože jsou levné, je jich možné připravit jakékoliv množství a po použití je vyhodit, diamantové nože jsou drahé, jejich cena závisí na délce řezné hrany a při jejich poškození je nutné je znovu za poměrně vysokou cenu přebrousit. Skleněný nůž je schopen ukrojit z jednoho místa ne řezné hraně asi 30 ultratenkých řezů a pak je nutné se na hraně posunout dále nebo nůž vyměnit, diamantový nůž po opatrném přiblížení čela bločku nakrájí tolik řezů, kolik potřebujeme.
Skleněné nože se lámou těsně před vlastním použitím ze skleněných tyčí pomocí zařízení, kterému se říká "knife maker"(obr. 4). Tyč skla se nejprve rozláme na čtverce o velikosti 2,5 cm x 2,5 cm, které se dále rozlomí na dva trojúhelníky (obr. 5). Kvalitnější nože získáme při tzv. rovnovážné metodě lámání (obr. 6), kdy se pomocí lámacího hrotu knife makeru skleněná tyč umístí do rovnovážné polohy, tzn. že se vyrovná váha obou částí tyče a tím i síla, která na ně při lomu působí. Pokud se lámání provádí pomalu jsou výsledkem ideálně rovné lomy, které zaručí úhel řezné hrany skutečně ve velikosti 45⁰, na rozdíl od rychlého lámání, kde je úhel nože vždy o něco větší. Vzhledem k nestabilnosti skla a korozi jeho povrchu vzdušnou vlhkostí ztrácí po třech dnech až týdnu skleněné nože schopnost ultratenkého krájení. Trvanlivost nože lze zvýšit pokovením wolframem. Před krájením je třeba u řezné hrany vytvořit vaničku (obr. 7), do které se napustí voda, na jejíž hladinu se splavují po skrojení ultratenké řezy. Vanička vznikne nalepením stříbrné pásky nebo plastového přípravku a utěsní se nejlépe lakem na nehty. Při přípravě nožů se snažíme nedotknout řezné hrany.
Kvalitu nožů hned po lámání určíme podle velikosti protiplošky (obr. 8), která by u nožů pro ultratenké krájení měla být menší než 0,2 mm. Další chyby lze odhalit v stereomikroskopu ultramikrotomu při vhodném osvětlení suchého nože (obr. 9). Připravené skleněné nože skladujeme na suchém a bezprašném místě (obr. 10).
Diamantový nůž poskytuje výrazně kvalitnější ultratenké řezy. Jeho cena odráží skutečnost, že diamant je nejtvrdší přírodní materiál, jehož opracování není snadné. Proto se většinou bločky předřezají na skleněném noži a diamantový nůž se použije až na ultratenké řezání. Hlavním problémem při použití diamantového nože je jeho čištění a hydrofóbnost, takže občas je problematické dostat hladinu ve vaničce k řezné hraně. Pokud na hraně nezůstaly zbytky pryskyřice, stačí nůž opláchnout proudem čisté vody nebo s přídavkem saponátu. Zbytky pryskyřice je možné odstranit přejetím hrany polystyrenovou tyčinkou namočenou v etanole nebo ve speciálních přístrojích určených pro mytí diamantového nože (obr. 11).

Ultramikrotom

Ultramikrotomy (obr. 12) jsou velmi spolehlivá zařízení, která se málokdy podílejí na problémech při přípravě ultratenkých řezů. V současné době se používají dva typy ultramikrotomů - ty, které k posuvu bločku k hraně nože využívají tepelné dilatace měděné tyče a druhou skupinu tvoří ultramikrotomy s mechanickým posunem. Předností termodilatačního ultramikrotomu je schopnost krájet i velmi tvrdé materiály, mechanický ultramikrotom je naopak velmi stabilní v tloušťce ultratenkých řezů. Výhody obou výrobci spojili u kombinovaných typů.
Na (obr. 13) je schéma ultramikrotomu, ze kterého je zřejmé, že v jeho pohyblivém vahadlu je umístěn bloček, který je přibližován k řezné hraně nože, upevněného ve stolku proti němu.

Síťky

Síťky slouží v transmisní elektronové mikroskopii k pohodlné manipulaci s ultratenkými řezy. Vyrábějí se z mědi, niklu, zlata a dalších materiálů elektrogalvanickým leptáním. Jejich průměr se v současnosti ustálil na 3 mm a v katalozích firem jich lze nalézt celou řadu lišící se tvarem, velikostí a uspořádáním otvorů (obr. 14). Samozřejmě nejlepší jsou síťky s velkými otvory, protože dovolují pozorovat větší plochu řezu. Ale skrývá se zde nebezpečí, že se řez prohne a popraská. Většina laboratoří používá síťky s ultratenkou loukotí, které jsou výrazně transparentnější.
Prohýbání řezů v důsledku osvitu elektronovým svazkem nebo příliš velkých ok použitých sítěk se dá zabránit potažením síťky tenkou blankou, která řez podepře. K těmto účelům se používají formvarové (obr. 15) nebo uhlíkové blány. Jejich nevýhodou je, že poměrně rychle stárnou a stávají se hydrofóbními, což ztěžuje nabírání řezů, ale přináší i menší kontrast v mikroskopu. Navíc tloušťku blány je třeba přičíst k tloušťce řezu, takže řezy by v tomto případě měly být tenčí.
Před vlastním použitím je třeba síťky omýt, protože mohou být znečištěné prachem a zbytky roztoků, které se mohou v mikroskopu nabíjet a způsobit deformaci obrazu. V naší laboratoři používáme postup, který je popsán v (Protokol č.10).

Krájení ultratenkých řezů.
Po zapnutí ultramikrotomu a jeho osvitu upevníme vzorek do vahadla ultramikrotomu, proti němu upevníme do stolku nůž. Vaničku nože naplníme kapalinou (obr. 16), nejčastěji vodou, protože nereaguje s řezy, má dostatečné povrchové napětí, takže řezy unese a není těkavá. Hladinu vody nastavíme tak, aby se dotýkala řezné hrany nože a dobře se na ní odráželo světlo. Začneme nůž a vzorek k sobě přibližovat (obr. 17) a vzdálenost kontrolujeme v stereomikroskopu podle stínu, který vrhá hrana nože na čelo bločku. Ten nám taky prozradí, zda jsou navzájem rovnoběžné (obr. 18). Je důležité, a to v případě skleněného i diamantového nože, aby se začaly hned od počátku krájet ultratenké řezy, protože síla , která při krájení působí na hranu nože, je přímo úměrná tloušťce řezu {tab. 1}. Skrojíme-li tlustý řez, výrazně si ztupíme skleněný nůž nebo se může poškodit diamantový nůž. Po přiblížení je možné zapnout automatický posun vahadla, které se začne pohybovat tak, že bloček na jeho konci opisuje elipsu. Při pohybu směrem dolů zavadí o hranu nože, skrojí se ultratenký řez, který se splaví na hladinu vaničky. Barva ultratenkého řezu charakterizuje jeho tloušťku. Pokud je správně nasměrované osvětlení vaničky (obr. 19) dochází k odrazu světla na povrchu řezu a na vodní hladině a v důsledku interference mají řezy v závislosti na tloušťce určitou barvu (obr. 20). Pro pozorování v klasickém TEM jsou nejvhodnější stříbrno-zlaté až zlaté řezy. Při odkrajování ultratenkého i polotenkého řezu dochází k jeho deformaci, kdy na horní straně je řez stlačován a na spodní straně natahován (obr. 21). Výsledkem je skutečnost, že řezy jsou po skrojení navlněné, nerovné. Proto se před sebráním na síťku vytahují např. působením par chloroformu nebo teplem. Pro snadnější sbírání řezů je výhodné, když se řezy po skrojení řadí za sebou a na hladině vaničky nože vytváří pásku (obr. 22).
Kvalitu výsledných ultratenkých řezů ovlivňuje během jejich krájení řada faktorů:
- především je to kvalita řezné hrany nože. Většina problémů při krájení je spojena s kvalitou nože a pokud se jedná o skleněný nůž, není nic snadnějšího, než ho vyměnit. Horší je to s diamantovým nožem. Pokud řezná hrana není dokonale rovná, lze na řezu ve směru řezání očekávat rýhy: velké, které je možné rozpoznat stereomikroskopem ultramikrotomu, často vedou po vytažení řezů k jejich rozpadnutí, malé, nepatrné jsou vidět až v TEM a mají tendenci na sebe adsorbovat kontrastující činidlo, takže jejich přítomnost ve výsledném obrazu je nezamaskovatelná. Ztupení řezné hrany vede k tomu, že po skrojení jednoho řezu se při následující otočce vahadla řez neskrojí a při další se skrojí řez dvojnásobné tloušťky.
- řezná rychlost je volitelným parametrem při krájení, může se pohybovat v intervalu 0,1-10 mm/s a její nastavení je závislé na tvrdosti bločku a typu nože. Čím je bloček tvrdší, tím pomalejší řezná rychlost se volí. V praxi se většinou při vyšších řezných rychlostech krájí metakrylátové pryskyřice, které bývají měkčí, k tvrdým pryskyřicím patří epoxidové. U skleněného nože můžeme s rychlostí více experimentovat než u diamantového, kde se z opatrnosti dává přednost pomalejším rychlostem.
- úhel krájení je dán součtem úhlu nože a úhlu zábřitu (obr. 23). Tento parametr lze měnit jen v malém rozsahu, pokud používáme nože s úhlem 45₀, protože úhel zábřitu se pohybuje od 4 do 6₀. Často ale i nepatrná změna úhlu zábřitu pomůže odstranit potíže se stahováním skrojených řezů přes hranu nože při pohybu bločku. Obecně platí, že tenčí řezy lze skrojit při menším úhlu zábřitu za cenu rychlejšího ztupení nože.
- typ a kvalita zalévacího média ovlivňují do značné míry výsledek řezání. Problematické je řezání měkkých, špatně zpolymerovaných bločků, které se na hladině rozprostřou do podoby mastných skvrn. Také při špatném prosycení objektu dochází k jeho vytržení z řezu a v následujícím řezu se tato oblast skrojí v dvojnásobné tloušťce (obr. 24). Na řezání má vliv i to, zda daná pryskyřice vykazuje hydrofobní nebo hydrofilní vlastnosti, kdy má tendenci vytahovat vodu z vaničky.
- velikost a tvar čela bločku do značné míry ovlivní, zda se na hladině vaničky budou řezy formovat do pásky či nikoliv. Pokud se nedaří získat ultratenké řezy vůbec, může pomoci zmenšení čela bločku.
- vibrace se projevují periodickým střídáním tenčích a silnějších částí řezu rovnoběžné s hranou nože (obr. 25). Vznikají přenášením kmitů z okolí, držáku ultramikrotomu nebo bločku. Při kmitání větších objektů, např. celého ultramikrotomu, vznikají na řezech barevné pruhy, které jsou rozpoznatelné pod stereomikroskopem. Při kmitání drobnějších částí, např. bločku, vnikají vibrace vyšších frekvencí, které jsou viditelné až v TEM. Frekvence vibrace se dá zjistit podle vztahu:
F = p.v / l

kde p je počet zesílení na délce l (mm) a v je řezná rychlost (mm/s). Vypočtená frekvence je v Hz a pokud je v intervalu 5-20 Hz jedná se o vibrace mimo ultramikrotom, do 500 Hz z velkých částí ultramikrotomu, do 1000 Hz celého nože a bloku, do 10000 Hz se jedná o vibrace částí řezné hrany nebo bloku. Vibrace ultramikrotomu se dají zmírnit jeho podložením např. pruhy gumy a zatížením. Při kmitání nože, stolku nože a bloku je třeba zkontrolovat stupeň opotřebení příslušných aretačních mechanismů. Při vysokofrekvenčních a lokalizovaných vibracích je třeba změnit parametry řezání - zmenšit sklon nože, rychlost řezání a zmenšit čelo bločku.
Po nařezání dostatečného počtu řezů se seberou na síťku, která se buď ponoří do vaničky, páska se přidrží řasou zasazenou do špejle (obr. 26) a síťka spolu s řezy se zhruba pod úhlem 45₀ vytáhne z vaničky (obr. 27), nebo se přiklopí na pásku řezů na hladině a opatrně se stáhne. Síťky pokryté řezy se skladují před kontrastováním v Petriho misce vyložené filtračním papírem.
K manipulaci se síťkami se používají speciální pinzety (obr. 28). K nejoblíbenějším patří křížové pinzety, které se nemusí aretovat gumovým kroužkem, pokud chceme síťku v pinzetě dlouho držet, nebo antikapilární pinzety, které zamezují přenášení kapky ve špičce mezi rameny pinzety.

Předchozí

Další

Literatura
Obrázky
	Obr.1 - A.Schematické znázornění trimovacího postupu, B.Vhodné tvary pyramid
	Zpět
	Obr.2 - Trimovací frézka firmy Leica
	Zpět
	Obr.3 - Diamantový a skleněný nůž
	Zpět
	Obr.4 - Zařízení pro přípravu skleněných nožů - knife maker
	Zpět
	Obr.5 - Postupné lámání skleněné tyče
	Zpět
	Obr.6 - Princip rovnovážné metody lámání skleněných nožů
	Zpět
	Obr.7 - Schéma lepení vaničky z plastu nebo stříbrné pásky u skleněného nože
	Zpět
	Obr.8 - Vznik protiplošky u skleněného nože
	Zpět
	Obr.9 - Určení kvality nože a délky použitelné hrany
	Zpět
	Obr.10 - Možnosti skladování připravených skleněných nožů
	Zpět
	Obr.11 - Myčka diamantového nože
	Zpět
	Obr.12 - Ultramikrotomy Ultracut E Reichert Jung a UCT Leica
	Zpět
	Obr.13 - Schema ultramikrotomu
	Zpět
	Obr.14 - Různé typy elektronmikroskopických sítěk
	Zpět
	Obr.15 - Umyté a formvarem potažené síťky
	Zpět
	Obr.16 - Plnění vaničky nože redestilovanou vodou z injekční stříkačky
	Zpět
	Obr.17 - Přiblížení čela bločku k řezné hraně nože
	Zpět
	Obr.18 - vyrovnání čela bločku s řeznou hranou nože
	Zpět
	Obr.19 - Správný nastavení odrazu světla na hladině vody ve vaničce,které umožňuje pozorovat barvu řezů
	Zpět
	Obr.20 - Závislost mezi barvou řezů a jejich tloušťkou
	Zpět
	Obr.21 - Síly působící na řez při jeho odkrajování z bločku
	Zpět
	Obr.22 - Vliv tvaru čela bločku na tvorbu pásky řezů na hladině vody ve vaničce nože
	Zpět
	Obr.23 - Úhel nože při krájení
	Zpět
	Obr.24 - Nestejná tloušťka řezu jako důsledek nedokonalého prosycení preparátu a různé tvrdosti vzorku a čisté pryskyřice
	Zpět
	Obr.25 - Chatter na řezu způsobený vibracemi
	Zpět
	Obr.26 - Speciální elektronmikroskopické nástroje - řasa zasazená do špejle, skleněná kulička na přenášení polotenkých řezů, žiletka na trimování
	Zpět
	Obr.27 - Různé postupy při sbírání řezů z vaničky nože
	Zpět
	Obr.28 - Pinzety používané k manipulaci se síťkami
	Zpět

Tabulky
Tab.1 - Síla působící na hranu nože při krájení 0,2 až 0,4 mm širokého řezu
Tloušťka řezu	Síla (mN)
80 nm	8
130 nm	9
1 µm	150
Zpět

Desing by NebeNet