......... Elektronová mikroskopie pro biology .........
© 2001 < Jana Nebesářová >
........Kapitola 4.5 - Zalévání 

Obsah:

Trocha historie...
Proč elektrony?
Transmisní
     elektronový
     mikroskop (TEM)
Příprava preparátů
     pro TEM chemickou
     cestou
Příprava preprátů
     pro TEM fyzikálními
     metodami
Další metody přípravy
     prepárátů pro TEM
Skanovací elektronový
     mikroskop (SEM)
Příprava preparátů
     pro SEM
Počítače a elektronová
     mikroskopie
Protokoly
Literatura
Autoři
Odkazy
Hl. stránka
Zavřít

Zalévání

Účelem zalévání je dát zpracovávanému vzorku takové vlastnosti, aby ho bylo možné nakrájet na ultratenké řezy tloušťky do 100 nm. Na pryskyřice, které se pro zalévání používají, je kladeno opět velké množství požadavků:
- měly by vykazovat dostatečnou mechanickou pevnost v tenké vrstvě
- být stabilní ve vakuu a při ozáření primárními elektrony
- neměly by rozptylovat primární elektrony, tedy nepřispívat obrazem vlastní struktury k výslednému obrazu na stínítku mikroskopu
- jejich polymerizace by měla být rovnoměrná bez objemových změn a poškození ultrastruktury
- pryskyřičné směsy by měly mít nízkou viskozitu a měly by být rozpustné v běžných dehydratačních činidlech, aby bylo možné preparát snadno a dobře pryskyřicí prosytit
- vzniklé bločky by měly mít přiměřenou tvrdost, aby se daly dobře krájet

Zalévací média - v současné době se na trhu nachází poměrně široké spektrum zalévacích médií {tab. 1}, které se liší ve svých vlastnostech a jejich výběr se řídí podle účelu a typu preparátu. Komerčně dodávané zalévací kity jsou vybaveny podrobnými návody, podle kterých je možné namíchat pryskyřici požadované tvrdosti. Při práci s pryskyřicemi je třeba používat rukavice a dobře větranou digestoř, neboť řada jejich složek vyvolává alergie a u některých se předpokládají karcinogenní účinky. Podle charakteru hlavní složky je možné je rozdělit do několika skupin:
Epoxidové pryskyřice - jsou to vícesložkové pryskyřice dlouhodobě používané v elektronové mikroskopii. Jejich výhodou je rovnoměrná polymerace bez větších objemových změn při 600 C. Tvrdost bločků lze modifikovat množstvím tvrdidla ve směsi. Jsou poněkud citlivější na osvit elektrony. Nejsou rozpustné v alkoholu, takže při jejich použití je třeba použít propylenoxid jako přechodovou kapalinu mezi dehydratačním činidlem a pryskyřicí. Podmínky polymerizace jsou pro různé pryskyřice této řady různé a uvádí je {tab. 2}. Dobře zpolymerované bločky mají světle žlutou barvu a přejetí nehtem na nich nezanechá žádnou stopu.
Mezi nejčastěji používané epoxidové pryskyřice patří Spurr, nesoucí název svého tvůrce, jehož hlavní složkou je vinylcyclohexendioxid. Jeho největší předností je nízká viskozita, doporučuje se proto pro zalévání např.rostlinného materiálu. Ultratenké řezy vykazují v TEM nižší kontrast.
Další velmi oblíbenou pryskyřicí je Araldit, který se míchá ze tří složek. Jeho značnou nevýhodou je větší viskozita, takže je nutné prodloužit prosycování nebo ho urychlit pomocí mikrovlnné trouby.
Epon je široce užívanou pryskyřicí od začátku šedesátých let. K jeho přednostem patří nízká viskozita, k záporům občas nestandardní tvrdost bločků a sklony k tvoření chatteru při krájení.

Akrylátové pryskyřice - patří k prvním zalévacím médiím, která se v nových variantách opět vrátila na výsluní díky svým specifickým vlastnostem, např. je možné je používat i při velmi nízkých teplotách. Při polymerizaci jsou citlivé na obsah vzduchu. Pro zalévání při nízkých teplotách jsou nejvhodnější želatinové nebo polyetylenové kapsle a při iniciaci UV světlem je třeba se vyhnout postfixaci OsO4, která by mohla způsobit nerovnoměrné vytvrdnutí bločku.
LR-white a LR-gold jsou média vyrobená firmou London Resin Company. K jejich přednostem patří nízká viskozita a snadná infiltrace. Jsou polární a hydrofilní, což je předurčuje pro imunocytochemické účely. LR-white je možné polymerizovat teplem při 500 C 24 hod, nebo při pokojové teplotě po přidání iniciátoru UV světlem. Pro nízkoteplotní zalévání je určen LR-gold po přidání iniciátoru.
Lowicryly patří také k pryskyřicím používaným pro imunocytochemické účely, protože jsou schopné polymerizovat za velmi nízkých teplot po iniciaci UV světlem.
Lowicryl K4M je polární pryskyřice, která je schopna polymerizovat s obsahem vody do 5 %, a může být použita až do -350 C. Lowicryl HM 20 je nepolární, hydrofobní pryskyřice, se kterou je možné pracovat při teplotách do -700 C.
Nejnovějším členem této skupiny je Unicryl, který byl uveden na trh v roce 1992 a je prezentován jako univerzální pryskyřice vhodná k imunoznačení jak pro optickou, tak i elektronovou mikroskopii. Je schopný polymerizovat při -350 C za iniciace UV světlem, stejně jako teplem při 500 C.

Polyesterové pryskyřice - jsou reprezentovány především Vestopalem W. Jeho nevýhodou je vyšší viskozita a tendence k samovolné polymerizaci. Vytvrzené bločky bývají ve srovnání s epoxidovými pryskyřicemi měkčí. V současné době se používá poměrně řídce.

Zalévací média mísitelná s vodou - vycházejí z potřeby minimalizovat extrakci a denaturaci, která se často vyskytuje při vyšších koncentracích dehydratačního činidla. Jedním z nejvíce používaných médií tohoto typu je Durcupan ACM, který je možné použít i k infiltraci (Protokol č.8). Bohužel, krájení této pryskyřice je velmi obtížné. Proto bývá často používán k dehydrataci, ale preparát je potom přenesen do jiné epoxidové pryskyřice.
Další s vodou mísitelnou pryskyřicí je Nanoplast, který patří do rodiny melaninových pryskyřic. Jeho používání není zatím příliš rozšířené.

Infiltrace - je postupné prosycení preparátu pryskyřicí. V praxi se provádí tak, že vzorek projde řadou roztoků pryskyřice v dehydratačním médiu s rostoucí koncentrací pryskyřice. V případě zalévacích médií s vyšší viskozitou nebo málo prostupného vzorku je možné zvýšit účinnost prosycení mikrovlnami nebo změnou tlaku (obr. 1).

Způsoby zalévání - existuje jich celá řada, jejich výběr závisí především na typu preparátu. V literatuře je popsána celá řada speciálních postupů, zde se zaměříme jen na dva nejčastěji používané:
Plošné zalévání - používá se v případě, kdy je vzorek třeba orientovat, aby oblast, kterou chceme připravit pro prohlížení, ležela co nejblíže řezné roviny bločku. Při plošném zalévání se používají nejčastěji silikonové formy (obr. 2), odolné agresivním složkám pryskyřic a změnám teploty, do jejichž připravených otvorů ve tvaru bločku se umístí vzorek spolu s označením, zaleje pryskyřicí až po okraj otvoru a po 15 min v termostatu se znovu pod lupou zkontroluje pozice vzorku. Nevýhodou plošného zalévání je, že velký povrch budoucího bločku je vystaven vzduchu, což ztěžuje polymerizaci některých pryskyřic (Spurr). U metakrylátových pryskyřic tento způsob nelze vůbec použít.
Zalévání do kapslí - je vhodné v případě suspenzí nebo jiného materiálu, kdy nezáleží na jeho orientaci. Kapsle různých tvarů a velikosti (obr. 3) se vyrábí bud z polyetylénu nebo želatiny. Jejich předností je také to, že zabraňují většímu kontaktu pryskyřice se vzduchem, což může způsobit problémy při polymerizaci (např. u metakrylátových pryskyřic, Spurr). Po vytvrdnutí se kapsle rozřízne a vzorek vyjme.
Po umístění vzorku do formy je třeba odstranit bublinky vzduchu, které se mohou vyskytovat v okolí vzorku, bud pomocí jehly nebo změny tlaku (vodní vývěva). Už při přípravě vícesložkových pryskyřic je třeba dbát na to, aby se do míchaného objemu nedostalo mnoho vzduchu a nedošlo k napěnění pryskyřice. Připravené zalévací hmoty je možné uložit v uzavřených plastových injekčních stříkačkách do mrazáku (obr. 4), kde většina vydrží nejméně tři měsíce. Po vyjmutí z mrazáku je třeba zajistit, aby se do pryskyřice nedostala voda, která se vysráží na povrchu stříkačky.

Polymerizace - existuje několik způsobů, jak nastartovat polymerizaci zalévacího média:
A/ teplem při teplotách do 600 C. Tento způsob je populární především u epoxidových pryskyřic, dochází při něm však k značnému snížení imunoreaktivity vzorku.
B/ ozářením UV světlem lze nastartovat polymerizaci především u akrylátových pryskyřic v teplotním intervalu od pokojové teploty dolů.
C/ přidáním chemického katalyzátoru nebo iniciátoru polymerizace. Ten často sám nestačí k započetí reakce a je třeba dodat energii v podobě UV světla nebo tepla.

Nízkoteplotní zalévání - metoda se označuje zkratkou PLT (progressive lowering of temperature) a používá se především při zalévání preparátů pro imunoznačení, aby se minimalizovala extrakce, agregace a přemístění buněčných komponent. Vychází se při ní z klasicky chemicky fixovaného vzorku, nejlépe směsí FA a GA. Dehydratace se provádí etanolem a začíná při 00 C. Teplota v dalších krocích klesá v závislosti na stoupající koncentraci etanolu až k -350 C nebo -500 C, přičemž nesmí dojít ke zmrznutí preparátu. Při požadované teplotě se provede infiltrace a UV světlem iniciovaná polymerizace. Pro tyto účely se dají použít pouze Lowicrylové pryskyřice (obr. 9).

Výběr pryskyřice při zalévání rozhodující měrou ovlivní i konečný vzhled ultrastruktury, jak dokazují fotografie myších hepatocytů na (obr. 5),(obr. 6),(obr. 7) a (obr. 8).




 Předchozí Další  

Literatura

Obrázky

Obr.1 - Eksikátor připojený k vodní vývěvě, používaný při infiltraci a zalévání
Zpět
Obr.2 - Formy pro plošné zalévání
Zpět
Obr.3 - Želatinové a polyetylénové kapsle na zalévání
Zpět
Obr.4 - Pryskyřice připravené do zásoby, uchovávané v mrazáku
Zpět
Obr.5 - Vliv výběru pryskyřice na výsledný ultrastrukturální vzhled preparátu - jaterní tkáň myši fixována GA a posfixována oxidem osmičelým, odvodněna acetonem, zalita na obr.5 do Eponu
Zpět
Obr.6 - do Durcupanu
Zpět
Obr.7 - do LR Whitu (bez postfixace)
Zpět
Obr.8 - do Lowycrilu HM 20 (bez postfixace)
Zpět
Obr.9 - Jaterní myšší tkáň běžně dvoustupňově fixovaná zalitá do Lowycrilu metodou PLT
Zpět

Tabulky

Tab.1 - Vlastnosti zalévacích médií
Metakrylát
(N-butyl, metyl)
Westopal W Araldit 502 Epon 812 Epon/Araldit
směs
Spurr
Viskozita nízká velmi vysoká vysoká vysoká vysoká nízká
Penetrace rychlá pomalá středně rychlá středně rychlá středně rychlá rychlá
Objemová změna
při polymerizaci
značná střední malá malá malá malá
Rozptyl elektronů nízký vysoký vysoký vysoký vysoký nízký
Rozpouštědla etanol
aceton
aceton
styren
dioxan
aceton
propylenoxid
aceton
propylenoxid
aceton
propylenoxid
etanol
aceton
Stabilita ve
svazku elektronů
špatná, sublimuje
nutno uhlíkovat
dobrá dobrá dobrá dobrá dobrá
Výhody nízká viskozita
zachovává antigenicitu
malé objem. změny (5%) vysoká stabilita
malé objem. změny
malé objem. změny
vyšší kontrast než Araldit
snadněji se krájí
než samotný Epon nebo Araldit
mísitelný s etanolem
nízká viskozita
Zpět



Tab.2 - Polymerizační podmínky pro různé epoxidové pryskyřice
Teplota polymerizace
(0C)
Doba polymerizace
(hod)
Spurr 70 8 - 12
Epon 60 24 - 72
Araldit a) 45 5
Araldit a) 65 48
Zpět
       Desing by NebeNet © 2001 < Jana Nebesářová >