Elektronová mikroskopie pro biology < Jana Nebesářová >

Podmínky fixace

Jak již bylo zmíněno v kapitole 4.1, výsledek fixace do značné míry závisí na řadě podmínek. Nejdůležitějším z nich budou věnovány následující odstavce.

Složení fixačního roztoku - s vyjímkou manganistanu draselného, který se užívá rozpuštěný v redestilované vodě, všechny ostatní fixační činidla se aplikují rozpuštěné v pufrovacích roztocích. Důvodem je, aby se fixační roztok co nejvíce blížil svými vlastnostmi, jako pH, teplota, osmolalita apod., prostředí, ve kterém se vzorek nacházel do chvíle odebrání a nedošlo k reakci fixovaného objektu na změnu vnějšího prostředí, která by mohla vést k jeho poškození např. smrštění fixovaných buněk.

Koncentrace fixačního činidla - závisí na druhu fixovaných objektů a způsobu fixace. Pro GA se doporučují koncentrace v intervalu 1-3 % v případě izolovaných buněk a perfúzní fixace, 3- 6 % pro tkáně a imerzní fixaci. Podobná doporučení platí i pro formaldehyd. U OsO₄ se doporučuje koncentrace 1-2 % a to jak pro primární fixaci, tak pro postfixaci.

pH fixačního roztoku - závisí na typu fixovaného vzorku. Průměrné pH extracelulární kapaliny člověka je blízké hodnotě 7,4, oproti tomu pH intracelulární kapaliny kolísá v rozmezí 6,0 - 7,5. Doporučovaná hodnota pH fixačního roztoku se pohybuje v intervalu 6,7 - 7,1. V této oblasti se dá očekávat dobrá reaktivita glutaraldehydu a i stabilita roztoku OsO₄. K udržení pH ve zvoleném intervalu se používají tlumící roztoky. Nepufrované aldehydické roztoky způsobují pouze malou změnu intracelulárního pH, naproti tomu v případě roztoků OsO₄ může pH klesnout na hodnotu mezi 2 a 3 a použití nepufrovaných roztoků nepřipadá v úvahu.

Vlastnosti pufrů - na pufry používané v elektronové mikroskopii jsou kladeny vysoké nároky. Kromě dostatečné tlumící kapacity by měly být chemicky stabilní a odolné proti degradaci enzymy a jinými biologicky aktivními látkami, neměly by být cytotoxické, neměly by disociovat a uvolňovat fyziologicky účinné ionty vápníku, draslíku, sodíku apod., neměly by tvořit precipitáty, interferovat s fixačním činidlem, inhibovat nebo naopak stimulovat buněčné funkce atd. Z celé velké škály tlumících roztoků nenajdeme ani jeden, který by beze zbytku splňoval uvedená kritéria. Mezi nejpoužívanější v současné době patří fosfátový a kakodylanový pufr a pufry označované zkratkami TRIS, PIPES, HEPES apod. které jsou většinou organickými deriváty aminokyselin. Mezi přednosti uvedeného seznamu pufrů patří především nízký stupeň toxicity, kompatibilita s fyziologickými funkcemi buněk, snížení extrakce lipidů, proteinů a dalších buněčných komponent v průběhu zpracování materiálu.

Fosfátový tlumící roztok - má řadu výhod, je levný, není toxický, cytoplazma a jádra získávají po aldehydové fixaci a postfixaci OsO₄ elektrodenzní vzhled, membrány a buněčné organely zůstávají dobře zachovány. Spolehlivě pufruje do pH 7,4. Mezi nevýhody patří reakce s roztoky uranylacetátu a citrátu olova používanými ke kontrastování a vznik sraženin v přítomnosti vápenatých iontů. Zásobní roztoky fosforečnanu draselného nebo sodného se skladují v lednici, jejich nevýhodou je krátká trvanlivost, kontaminují se bakteriemi a vznikají v nich do dvou týdnů zákaly (Protokol č.6).

Kakodylanový tlumící roztok - používá se často při aldehydové fixaci. Jeho nespornou výhodou je velká trvanlivost zásobních roztoků, nevýhodou je vysoká cena a toxicita daná obsahem arsenu. I když vlastní roztok nemá přímé dráždivé účinky, může se vstřebávat kůží a vdechováním, což při dlouhodobé expozici může způsobit zdravotní potíže. Na rozdíl od fosfátového pufru nemá sklony ke vzniku precipitátů, ale občas se může vyskytnout osmotické poškození buňky (Protokol č.7).

Přídavky jiných látek - některé látky svojí přítomností ve fixačním roztoku selektivně fixují určité organely, některé ovlivňují reaktivitu fixačního činidla, rychlost jeho pronikání do tkáně apod. {tab. 1} a tak ovlivňují výsledky fixace.
Peroxid vodíku - jeho přídavek k fixačnímu roztoku GA výrazně zlepšuje kvalitu fixace. Důvodem je nejpravděpodobněji prosycení roztoku kyslíkem, který je potřebný k respiraci tkáně a také k reakcím GA se složkami tkáně.
Saponín, dimetylsulfoxid - jsou látky, které zvyšují permeabilitu membrán. Zatímco dimetylsulfoxid při dlouhodobější expozici způsobuje extrakci cytoplazmy, u přídavku saponínu při koncentraci 0,1 % k extrakci cytoplazmy nedochází. Saponín naproti tomu snadno vytváří pěnu na hladině fixačního roztoku, kde se mohou zachytit fixované vzorky.
Tanín - velmi často se přidává do fixačních roztoků, protože zlepšuje vizualizaci fibrilárních elementů (mikrotubulů a mikrofilament) a plasmatické membrány zvýšením jejich kontrastu. Aby se tento jeho účinek projevil, je třeba ho aplikovat před fixací OsO₄ zároveň s přídavkem saponínu, který mu umožní proniknout dovnitř buněk. Dále se v tomto případě doporučuje použít fosfátový pufr (připravený ze sodné soli, s draselnou solí tanín reaguje za vzniku sraženiny) a kontrastování citrátem olova. Nejlépe zachovanou ultrastrukturu při nízkých penetračních schopnostech tanínu lze očekávat na povrchu preparátu.
Ferokyanid draselný - přidává se do fixačních roztoků OsO₄ ke zvýšení kontrastu membrán. Lepšího účinku se dosahuje současným přídavkem vápenatých iontů. Tento postup se doporučuje převážně pro selektivní barvení membrán endoplazmatického retikula, bývá však doprovázen extrakcí ostatních složek buněčné ultrastruktury.

Osmotické vlastnosti fixačního roztoku - buňky obsahují velké množství intracelulárních roztoků, které jsou uzavřeny a navzájem od sebe odděleny semipermeabilními membránami. Vně buněk jsou extracelulární kapaliny a v živém organismu membrány fungují jako selektivní bariéry a propouštějí do tohoto vyrovnaného systému jen některé látky a vodu. Pohyb vody přes semipermeabilní membrány je dán rozdílem koncentrací roztoků, které odděluje, a sice ze strany nižší koncentrace roztoku směrem k vyšší, který zřeďuje. Čím je rozdíl koncentrací vyšší, tím větší je tlak vody na membránu. Tento tlak se označuje jako osmotický a udává hydrostatický tlak, který by bylo třeba vyvinout na straně koncentrovanějšího roztoku, aby se zabránilo proudění vody do něj. Při fixaci je důležité, aby vzorky po ponoření do fixačního roztoku nebyly vystaveny velké změně osmotického tlaku, aby nepřijímaly vodu ani ji neuvolňovaly, což by mělo za následek velkou objemovou změnu buněk. Roztoky, ve kterých dochází ke zvětšení objemu buněk se označují jako hypotonické, opačně působí hypertonické roztoky. Ideální jsou izotonické roztoky, které nevyvolávají objemové změny. Právě takovými by měly být fixační roztoky. Osmotické vlastnosti roztoku se dají měřit osmometrem a udávají se v osmech na 1 kg rozpouštědla (osmolalita), nebo na 1 l rozpouštědla (osmolarita), přičemž osmol je mol dělený počtem iontů vzniklých úplnou disociací jedné molekuly na ionty. Tlak elektrolytů je vždy vyšší než neelektrolytů, protože jejich molekuly disociují na více částí. Proto 0,16 M roztok NaCl má stejnou osmolalitu jako 0,3 M roztok glukózy.
Při stanovení optimálních osmotických vlastností se většinou vychází z osmotické koncentrace lidského séra, která je asi 300 mOsm/kg. Při fixaci je výhodné fixovat mírně hypotonickým roztokem, aby obsah fixační látky proudil dovnitř buněk. Membrány si však při fixaci GA dlouho zachovávají své semipermeabilní vlastnosti a GA nepatří k látkám, které by ochotně pouštěly dovnitř buněk. Často zůstávají buňky osmoticky aktivní i po fixaci GA a při použití vypíracího roztoku s nevhodnými osmotickými vlastnostmi, může stále dojít k jejich poškození. Při určování osmotické koncentrace fixačního roztoku je třeba stanovit tzv. účinnou osmolalitu, která se může lišit od celkové, např. GA v koncentraci 2-6 % není osmoticky aktivní. OsO₄ naproti tomu okamžitě ničí semipermeabilní vlastnosti membrán a v tomto případě se účinná osmotická koncentrace rovná celkové včetně podílu OsO₄.
V {tab. 2} jsou uvedeny hodnoty osmolarity řady běžně používaných pufrů a fixačních roztoků. Snížení osmolarity roztoku lze docílit přidáním vody, zvýšení přídavkem glukózy a sacharózy nebo kationtů (K+, Na+, Mg2+, Ca2+). Výsledný vzhled ultrastruktury vypoví, zda měl fixační roztok správnou osmolaritu. Scvrknuté buňky a buněčné organely byly fixovány hypertonickým roztokem, zvětšené buňky a organely, kulatá jádra hypotonickým roztokem Nejcitlivěji reagují na nevhodnou osmotickou koncentraci mitochondrie.

Teplota fixačního roztoku - do značné míry ovlivňuje penetrační rychlost fixačního činidla na jedné straně, na druhé straně i rychlost autodegradačních a autolytických procesů ve fixovaném materiálu. Zatímco pro pronikání fixačního roztoku do buněk je vhodnější vyšší teplota, pro zbrzdění autodegradačních procesů teplota nižší. Na určení vhodné teploty má vliv celá řada faktorů, především způsob fixace, např. při perfúzní fixaci je vhodné upravit teplotu na hodnotu živého organismu. Určení konkrétní teploty fixačního roztoku je vždycky kompromisem mezi několika faktory.

Doba fixace - závisí na velikosti fixovaného materiálu, teplotě fixačního roztoku, jeho složení, způsobu fixace atd. Obecně neplatí, že čím déle fixujeme, tím lepší výsledky, neboť proteiny změněné na gel reakcí s GA po čase kapalní a potom jsou odplaveny během dalších kroků přípravy. Bylo změřeno, že průměrná rychlost penetrace fixačních roztoků při pokojové teplotě je 0,2 až 0,34 mm/hod. Při imerzní fixaci vzorku o velikosti 1 mm₃ pronikne fixační roztok do jeho středu za 1,5 až 2,5 hod. Při celkové délce fixace 3 hod jsou však buňky ve středu vzorku fixované pouze 30 min, zatímco na povrchu 3 hod. Při pokusech stanovit optimální délku fixace se ukázalo, že na imobilizaci pohybu v rostlinné cytoplazmě potřeboval GA 15-20 min, FA 30 min, akrolein 6 min.

Množství fixačního roztoku a promíchávání - závisí především na způsobu fixace. Při imerzní fixaci se doporučuje, aby objem roztoku byl asi 1000 krát vyšší než objem fixovaného vzorku, aby byl zajištěn dostatek fixačního činidla. Tedy na fixaci 5 kusů vzorku o objemu 1 mm₃ by se mělo použít asi 5 ml roztoku. Při perfuzní fixaci bývá objem spotřebovaného fixačního roztoku ještě vyšší. Stejně důležité je i jemné promíchávání při fixaci, aby se podpořila penetrace fixačního roztoku do vzorku (obr. 1).

Způsob fixace - je většinou nejvíce ovlivněn účelem pokusu. Nejběžnějším, nejjednodušším a nejčastěji používaným způsobem je imerzní fixace spočívající v ponoření získaného materiálu do fixačního roztoku. V případě citlivých tkání, např. jaterní, je však tento způsob pomalý a v ultrastruktuře je již možno pozorovat poškození způsobené degradačními procesy. Perfúzní způsob fixace je možné použít při experimentu na pokusném zvířeti, kterému se v celkové anestézii vstřikuje fixační roztok přímo do krevního řečiště. Dalším způsobem je možnost předfixovat tkáň určenou k odebrání pomocí injekce s fixačním roztokem, nebo opět při celkové anestézii obnažit hledaný orgán a nakapat na něj fixační roztok a teprve poté odebrat kousky tkáně. V případě vzorků tkání ze živého člověka získaných biopsií připadá v úvahu pouze imerzní fixace, tedy co nejrychlejší ponoření získaných vzorků do fixačního roztoku. Postupy, jak získat excizi, jsou podrobně popsány v histopatologických příručkách. Pro vzorky určené pro transmisní elektronovou mikroskopii platí, že by neměly přesahovat velikost 1 mm₃. Často bývá problém s fixací izolovaných buněk v suspenzi, které je nutno pro jednodušší manipulaci zalít do agaru. Pokud je počet buněk v suspenzi nízký, je třeba je zkoncentrovat filtrací přes membránový filtr, filtr rozstříhat na malé kousky a pracovat s nimi jako s kousky excize. Pouze při odvodňování a zalévání je třeba zajistit, aby se v některém kroku filtr nerozpustil. Z uvedeného stručného přehledu vyplývá rozmanitost postupů používaných k fixaci, které odráží variabilitu připravovaných preparátů.

Předchozí

Další

Literatura
Obrázky
	Obr.1 - Rotátor vyráběný firmou Agar k pomalému promíchávání
	Zpět

Tabulky
Tab.1 - Přídavky k fixačním roztokům a jejich vliv na průběh fixace
Látka	Doporučená koncentrace	Účinek
Peroxid vodíku	asi 80mM s GA	ovlivnění reaktivity GA
Dimetylsulfoxid	128-639 mM s GA	zlepšení fixace permeabilizací buněčných membrán
Saponin	0,1 % s GA	zlepšení fixace permeabilizací buněčných membrán
Tanin	0,2 - 8% s GA + saponin nebo mezi fixací GA a OsO₄	ochrana některých struktur před zničením při fixaci OsO₄
Oxid osmičelý	1,9 mM s GA	zlepšení fixace permeabilizací buněčných membrán
Fero a ferikyanid draselný	12 - 60 mM s OsO₄ po GA	zachovává některé nestálé struktury zvyšuje kontrast
Chlorid vápenatý	1 - 4,5 mM s GA	zabraňuje poškození mitochondrií může způsobit změnu u jiných struktur
Thiokarbohydrazid	95 mM v H₂O mezi opakovanou postfixací OsO₄	zvýšení kontrastu hlavně membrán deponovaním osmia v tkáni
Sloučniny La	5mM LaCl₃ těsně před GA 5-20 mM LaNO₃před nebo spolu s GA	stabilizace proteoglykanů denzní precipitát na povrchu cytomembrán
Uranylacetát	5-10 mM v pufru po GA a OsO₄	zvýšení kontrastu hlavně membrán vlastní fixační účinek
Zpět

Tab.2 - Osmolalita vybraných roztoků
Roztok	Koncentrace (M)	Osmolalita (mOs)	Koncentrace (M)	Osmolalita (mOs)
Fosfátový pufr	0,05	118	0,1	226
	0,15	350	0,2	400
Kakodylanový pufr	0,05	100	0,1	205
	0,2	420
GA čistý	0,1 (1%)	100	0,2 (2%)	220
	0,3 (3%)	330
Oxid osmičelý	0,04 (1%)	50	0,08 (2%)	75
Chlorid sodný	0,05	90	0,1	190
	0,2	380	0,3	560
Sacharóza	0,1	100	0,2	220
	0,3	340	0,4	460
Chlorid vápenatý	0,001	2	0,005	12
Zpět

Desing by NebeNet