......... Elektronová mikroskopie pro biology .........
© 2001 < Jana Nebesářová >
........Kapitola 8.1 - Chemické metody 

Obsah:

Trocha historie...
Proč elektrony?
Transmisní
     elektronový
     mikroskop (TEM)
Příprava preparátů
     pro TEM chemickou
     cestou
Příprava preprátů
     pro TEM fyzikálními
     metodami
Další metody přípravy
     prepárátů pro TEM
Skanovací elektronový
     mikroskop (SEM)
Příprava preparátů
     pro SEM
Počítače a elektronová
     mikroskopie
Protokoly
Literatura
Autoři
Odkazy
Hl. stránka
Zavřít

Chemické metody

Obvykle příprava biologického objektu pro SEM zahrnuje následující kroky:
- výběr vzorku, jeho odebrání a v případě potřeby očištění
- fixace preparátu nejčastěji ponořením do fixačního činidla
- vymytí fixačních roztoků a dehydratace
- vysušení preparátu a jeho nalepení na nosný terčík
- zvýšení povrchové vodivosti preparátu
Celý tento postup zabere zhruba dva až tři dny. Samozřejmě je nutné dbát na to, aby nedošlo během přípravy k poškození povrchu vzorku, např. při centrifugování, protřepávání, ke svraštění a popraskání v důsledku objemových změn, při přenášení preparátu z jedné nádoby do druhé apod.

Velikost preparátu
Je omezena na jedné straně velikostí posuvu stolku preparátů, na straně druhé způsobem jeho přípravy. Pokud nás zajímá pouze vnější povrch, můžeme si dovolit imerzně fixovat i velké preparáty v rozměru několika cm, v případě zájmu o vnitřní povrchy, je třeba počítat s pomalou penetrací fixačního činidla a tomu přizpůsobit rozměr vzorku. U velkých vzorků také často nastává problém s jejich dokonalým vysušením. Doporučuje se vzorky zmenšovat po aldehydové fixaci novou hranou žiletky na měkké podložce, aby se minimalizovaly deformace způsobené tlakem nástroje.

Očištění preparátu
Jen zřídka se vyskytne vzorek, jehož povrch je bez kontaminací. U větších částic můžeme použít k odstranění jemnou jehlu a pracovat pod stereomikroskopem, nebo se pokusit objekt opláchnout isotonickým roztokem např. s NaCL nebo HCl. Po fixaci je možné k omývání použít kakodylanový nebo fosfátový pufr. U suspenzí je možné použít opakovanou opatrnou centrifugaci. Z dalších metod, používaných k očištění povrchu preparátu, které se řadí do kategorie nebezpečných, je třeba ještě zmínit sonifikaci nebo ofukování tlakovým vzduchem.

Chemická fixace
Hlavním účelem fixace je stejně jako v TEM stabilizovat preparát co nejblíže nativnímu stavu a zamezit autodegradačním procesům. Navíc se od fixace očekává zpevnění povrchových struktur preparátu určených k pozorování. K fixaci se nejvíce používají aldehydy a oxid osmičelý ve stejné koncentraci jako v TEM.
Nejlepších fixačních výsledků je dosahováno při použití glutaraldehydu. Jeho velkou nevýhodou při přípravě preparátů pro SEM je, že jen velmi pomalu proniká do větších vzorků, které se pro SEM fixují velmi často. Z tohoto důvodu je třeba při jeho použití prodlužovat časy fixace. Formaldehyd vyniká rychlejší penetrací do vzorku a proto je vhodnější k fixaci větších objektů, kde nezáleží na zachování buněčné ultrastruktury.
Oxid osmičelý se používá k fixaci pro SEM zhruba ve stejných koncentracích jako v TEM. Výhodou je jeho reaktivita a z ní vyplývající rychlost fixace, dále nízký osmotický účinek a zvýšení permeability membrán po jeho aplikaci. Při fixaci neproniká příliš rychle do vnitřku preparátu, zůstává na povrchu, díky tomu jej zpevňuje a přispívá také ke snížení nábojových artefaktů.
V případě suchých objektů, nebo vzorků, u kterých by mohlo dojít k poškození povrchu, se využívá vysoké těkavosti oxidu osmičelého a tyto preparáty se fixují v jeho parách. Prakticky se tato metoda provádí tak, že vzorek se spolu s několika krystalky oxidu osmičelého umístí do dobře těsnící skleněné nádobky a ponechá např. v mrazáku lednice několik dní. Oxid osmičelý zreaguje na povrchu preparátu a tím jej zpevní. Zároveň dojde k jeho dosušení.
Dvoustupňová fixace glutaraldehydem a oxidem osmičelým se nejvíce používá při přípravě měkkých živočišných tkání, kde přináší mechanické zpevnění povrchových struktur. V případě rostlinných vzorků, které vykazují dostatečnou mechanickou pevnost, je postfixace osmiem diskutabilní.
Fixační roztoky se připravují opět v kombinaci s tlumivým roztokem, nejčastěji se používá 0,1 M fosfátový nebo kakodylanový pufr. Pro složení fixačních roztoků platí stejná pravidla jako v TEM (viz kap.4.2 a 4.3), takže výsledný roztok by měl mít vhodnou osmolalitu a pH, aby nedošlo např. k objemovým změnám vzorku, které by se mohli projevit jeho svraštěním.
Čas fixace je přímo úměrný velikosti preparátu. Rychlost fixace lze ovlivnit teplotou, většinou se fixuje při pokojové teplotě, výhodné je urychlit fixaci mikrovlnným ohřevem. Promývání vzorků po fixaci se provádí vypíracími roztoky, které se skládají z pufru a přídavku sacharózy nebo glukózy. Praní vzorků se provádí důkladně, aby povrch, který bude prohlížen, byl zbaven všech nečistot. K provedení se volí nejčastěji imerzní či perfúzní způsob fixace.

Odvodnění
Cílem je postupné nahrazení vody ve vzorku organickým rozpouštědlem. K odvodnění se používají rozpouštědla dobře mísitelná s vodou, nejčastěji etanol, aceton. Při odvodnění vzorek projde řadou roztoků se zvyšující se koncentrací organického rozpouštědla, např. 30, 50, 70, 80, 90, 95 a 100 % (Protokol č. ). Důležitou podmínkou je, aby preparát během odvodňování byl stále pod hladinou roztoků a nevyschnul. Čas jednotlivých kroků při odvodňování závisí na velikosti preparátu a pohybuje se od 10 do 30 min. Urychlení a zkvalitnění tohoto procesu dosáhneme ozářením v mikrovlnné troubě v každém kroku odvodnění.
Absolutní etanol a aceton se připraví promícháním těchto roztoků s bezvodou modrou skalicí, která se v nich nerozpouští. Tyto roztoky je třeba odebírat opatrně, abychom si povrch preparátu nekontaminovali krystalky modré skalice. Pokud k sušení vzorku plánujeme použít metodu kritického bodu, je třeba vzorky v etanolu v závěru převést do acetonu nebo izoamylacetátu z důvodu omezené mísitelnosti etanolu s kapalným oxidem uhličitým, který se při metodě kritického bodu používá.
Alternativou k odvodnění acetonem nebo etanolem je dehydratace pomocí 2,2-dimetoxypropanu. V tomto případě se objekt přenese po fixaci a promytí do 100 % 2,2-dimetoxypropanu, který reaguje s vodou za vzniku metanolu a acetonu (viz kap 4.4). Po 2 minutách se roztok nahradí čerstvým, ve kterém se vzorek ponechá minimálně hodinu. Rekce 2,2-dimetoxypropanu s vodou je exotermická, což může být jeden z důvodů, proč ve většině případů výsledky tohoto postupu nejsou tak dobré, jako při použití acetonu nebo etanolu k odvodnění.


Sušení
Po úplném nahrazení vody je vzorek třeba zbavit dehydratačního činidla. Vzhledem k existenci povrchového napětí, které je příčinou tvarových deformací při sušení na vzduchu, nelze tento postup u většiny preparátů použít. Řešením je metoda kritického bodu, která umožňuje vyhnout se působení povrchového napětí dehydratační kapaliny na preparát a v současné době patří mezi nejpoužívanější a nejrozšířenější postup sušení.
Metoda kritického bodu je založena na skutečnosti, že při zahřívání kapaliny v omezeném prostoru se docílí stavu, který se označuje jako kritický a je charakterizován kritickou teplotou a tlakem. V tomto stavu mizí veškeré rozdíly mezi oběma fázemi dané látky, mají stejnou hustotu a měrný objem, nejsou odděleny rozhraním a povrchové napětí klesá na nulu. Právě v tomto bodě je výhodné převést kapalinu na plyn, který se vypustí z uzavřené komory, a tímto způsobem vysušit připravovaný vzorek bez poškození povrchovým napětím kapaliny, ve které se nachází. Docílit kritické teploty a tlaku v laboratorních podmínkách je možné pouze u některých kapalin {tab. 1}. Nejvíce se k těmto účelům využívá kapalný oxid uhličitý, který je běžně dostupný a levný. Metoda se provádí ve speciálních aparaturách (obr. 1), dodávaných různými firmami. Nejprve se vodou nebo adiabatickou expanzí vychladí tlaková komůrka přístroje a potom se do ní vloží preparáty umístěné ve vhodných nosičích (obr. 2) a komora se dobře uzavře. Vkládání vzorků je kritickou operací. Je třeba pracovat rychle, aby nedošlo k předčasnému vysušení vzorků na vzduchu. Komora se pomalu, aby nevznikly turbulence, které by mohly poškodit preparát, napustí kapalných oxidem uhličitým. Ten se několikrát vymění, aby došlo k úplnému nahrazení organického rozpouštědla. Po odpuštění cca 1/3 obsahu komory ji začneme zahřívat. S rostoucí teplotou roste i tlak v komoře, až dosáhne kritického bodu (360 a6 400 C). Potom otevřeme vypouštěcí ventil a pomalu, aby rychlá dekomprese nepoškodila vzorky, vypustíme plynný oxid uhličitý. Po dosažení atmosférického tlaku komoru otevřeme a vyjmeme vysušené preparáty. I když ve většině případů metoda kritického dává vynikající výsledky, i při ní mohou vzniknout artefakty: vysušením preparátu na vzduchu při jeho přenášení do komory aparatury, nedostatečným odstraněním organického rozpouštědla ze vzorku, turbulencemi při napouštění a vypouštění komory nebo při jejím zahřívání, nedosažením kritického bodu, rekondenzací oxidu uhličitého při příliš rychlém vypouštění natlakované komory apod.

Alternativní sušící metody
V úvahu přichází při sušení preparátů, které jsou příliš citlivé např. na tlakové nebo teplotní změny, takže nelze použít metodu kritického bodu. Možnosti jsou zhruba dvě. Buď použít sušení na vzduchu za použití látek, které mají nízké povrchové napětí a jsou dobře rozpustné v běžných organických rozpouštědlech. Druhou možností je použít vakuovou sublimaci t-butanolu nebo komerčně dodávané sloučeniny Peldri II, což jsou látky , které jsou při teplotách nad 250 C kapalné. Vzorek se po odvodnění jimi prosytí a potom se vloží na několik minut do lednice, kde tyto sloučeniny ztuhnou bez tvorby krystalů. Po přenesení do rotačkového vakua dojde k sublimaci a vysušení preparátu.

Lepení preparátu
Aby nedošlo k opětovnému navlhnutí preparátu, je třeba jej co nejdříve nalepit na vhodný nosič a pokovit (obr. 3). Nosiči jsou nejčastěji hliníkové kruhové podložky lišící se průměrem u různých typů SEM. I lepidlo musí vyhovovat řadě požadavků: nesmí obsahovat vodu, nemělo by být hygroskopické, mělo by být nevzlínavé, aby nezakrývalo povrchové detaily vzorku, mělo by být stabilní ve vakuu a neměnit zde své vlastnosti, tzn. udržet vzorek na nosiči při náklonu, mělo by být elektricky vodivé a nemělo by emitovat stejně jako nosič zpětně odražené elektrony. Velké objekty se zpravidla lepí přímo na hliníkový terč pomocí koloidního stříbra, malé objekty pomocí oboustranně lepící uhlíkové nebo adhesivní pásky. Lepení se kontroluje pomocí binokulární lupy, aby vzorky byly v nejoptimálnější poloze při prohlížení. K manipulaci s nepatrnými objekty se používá řasa zasazená do špejle, u větších objektů entomologické pinzety. Je důležité zajistit vodivost preparátu a v případě potřeby pomocí koloidního stříbra vytvořit vodivé mosty např. na hranicích mezi povrchem nosiče a lepící páskou nebo krycím mikroskopickým sklíčkem.





 Předchozí Další  

Literatura

Obrázky

Obr.1 - Aparatura Pelco CPD II. pro sušení vzorků metodou kritického bodu
Zpět
Obr.2 - Nosiče, do kterých se umísťují preparáty při sušení metodou kritického bodu
Zpět
Obr.3 - Vysušené vzorky nalepené na nosné hliníkové terče a pozlacené
Zpět

Tabulky

Tab.1 - Kritický tlak a teplota některých sloučenin
Sloučenina Rozpustnost Kritická teplota (0C) Kritický tlak (atm)
voda ---- 374 217,7
oxid uhličitý aceton, amylacetát 31,1 72,9
Freon 116 aceton 19,7 29,4
oxid dusný ---- 36,5 70,8
Zpět
       Desing by NebeNet © 2001 < Jana Nebesářová >