Elektronová mikroskopie pro biology < Jana Nebesářová >

Protokol č.1 - přečištění roztoku GA pomocí aktivního uhlí

1/ Roztok GA zředíme redestilovanou vodou na koncentraci 0,599 M (6%).
2/ Ke zředěnému rozotku přidáme aktivní uhlí v množství odpovídajícím zhruba 10 hmot.% z původního objemu GA v koncentraci 25 %.
3/ Vzniklou suspenzi mícháme na magnetickém míchadle 2 hod.
4/ Aktivní uhlí odstraníme filtrací pomocí např. Buchnerovy nálevky připojené k vodní vývěvě. Filtrační papír volíme s malými póry (Whatmann č. 40 a č.42).
5/ Čistotu GA zkontrolujeme pomocí UV spektrometru. Koncentraci GA v roztoku stanovíme jodometrickou titrací.

Zpět

Protokol č.2 - Stanovení koncentrace rozotku GA jodometrickou titrací

Připravené roztoky: roztok GA zředěný na koncentraci 59 - 599 mM (0,6 - 6 %), 0,25 M NaHSO₃ (26 g/l), 0.1 M roztok jódu (44 g KJ se rozpustí v 150 ml redestilované vody, přidá se 25,78 g resublimovaného jódu a po rozpuštění se doplní vodou na objem 1000 ml)
Postup:
1/ Do jedné titrační baňky o objemu 125 ml se napipetuje 1 ml analyzovaného roztoku GA, do druhé stejné množství vody (slepý pokus). Do obou se přidá 20 ml roztoku NaHSO₃ a po promíchání se nechají stát 5 až 10 min.
2/ Byretu naplníme titračním roztokem jódu.
3/ Nejprve titrujeme roztok GA, potom slepý pokus, během titrace roztoky promícháváme. Po úvodním zežloutnutí roztoku dojde zhruba 0,2 ml před titračním bodem k jeho odbarvení. Po kapkách opatrně dotitrujeme, dokud se roztok nezbarví znovu do žluta a vydrží zbarvený alespoň 3 min. Odečteme spotřebu titračního roztoku.
4/ Koncentraci GA určíme ze vztahu:

% GA = K.(S₂ - S₁).100,12.100 / 2V

kde K je koncentrace titračního roztoku v M, S₁ je spotřeba titračního roztoku při titraci roztoku GA v ml, S₂ je spotřeba při titraci slepého pokusu v ml a V je objem stanovovaného roztoku GA.
Přesnost stanovení se pohybuje kolem 0,2 %, přičemž výsledná koncentrace se týká pouze reaktivní monomérní složky. Metodu lze použít i pro roztoky GA ve fosfátovém nebo kakodylátovém pufru a za přítomnosti sacharózy.

Zpět

Protokol č.3 - Příprava fixačního roztoku GA a FA

Podle původní receptury, publikované v roce 1965 Karnovskym, fixační rozok obsahoval 5% GA a 4% FA v kakodylátovém pufru a byl velmi hypertonický. V současnosti se používají mnohem nižší koncentrace obou fixačních složek bez výrazného zhoršení kvality fixace.
Potřebné chemikálie: práškový paraformaldehyd, 25 % GA (pro EM), 1 M roztok NaOH, O,1 M kakodylátový nebo fosfátový pufr
Postup:
1/ 2 g paraformaldehydu se zahřejí v 10 ml redestilované vody na 65-70⁰C za mírného promíchávání. Vznikne mléčně zakalený roztok, který se vyčeří po přidání několika kapek 1 M NaOH. Vzniklý 20% roztok FA ochladíme na pokojovou teplotu.
2. Vlastní příprava fixáže 2,5 % GA a 2% FA: 10 ml 25 % GA a 10 ml 20% FA přidáme do 80 ml 0,1M fosfátového nebo kakodylátového pufru. Osmolalita fixačního roztoku může být upravena přidáním sacharózy nebo NaCl. pH roztoku je třeba nastavit mezi 7,2 a 7,4.

Zpět

Protokol č.4 - Příprava fixačního roztoku oxidu osmičelého

Potřebné chemikálie: skleněná zatavená ampule s 1 g krystalického OsO₄, koncentrovaná kyselina dusičná
Postup:
1/ Ze skleněné ampule je třeba odstranit nálepky i se zbytky lepidla, umýt ji spolu se skleněnou tyčinkou v koncentrované kyselině dusičné a opláchnout studenou destilovanou vodou.
2/ Takto připravená ampule se vhodí do skleněné lahve s 25 ml redestilované vody. Dbáme na to, abychom se ji již nedotýkali holou rukou. Pod vodou v láhvi ampuli rozbijeme a za stálého protřepávání v uzavřené láhvi necháme rozpouštět několik hodin, nejlépe přes noc. Rozpouštění je možné urychlit sonifikací.
3/ Vzniklý světle žlutý roztok je třeba pro dlouhodobější skladování rozpipetovat do perfektně odmaštěných skleněných ampulí a zatavit. Skladovat nejlépe v lednici. Pokud roztok změní barvu, nelze ho již k fixaci použít.

Zpět

Protokol č.5 - Recyklace použitých fixačních roztoků OsO₄

Potřebné chemikálie: cca 500 ml použitých roztoků OsO₄ v koncentraci 0,5 - 1 % ve fosfátovém nebo kakodylátovém pufru, koncentrovaná H₂SO₄, 0,38 M vodný roztok KMnO₄, CCl₄, bezvodý etanol, aceton, 8,82 M roztok H₂O₂
Upozornění: vzhledem k vysoké těkavosti a jedovatosti par OsO₄ je nazbytné provádět všechny práce v digestoři
Postup:
1/ 500 ml dobře promíchaného použitého roztoku OsO₄ přelejeme do zábrusové láhve o obsahu 100 ml a přidáme 5 ml koncentrované kyseliny sírové a 200 ml roztoku manganistanu draselného. Necháme stát 30 min při pokojové teplotě v digestoři.
2/ Roztok přelejeme do dělící nálevky a vytřepeme se 150 ml CCl₄. Po oddělení fází slijeme CCl₄ a vytřepávání ještě dvakrát zopakujeme.
3/ K CCl₄ přidáme 10 ml bezvodého etanolu a necháme stát při pokojové teplotě 48 hod. V roztoku vzniká OsO₂, který se postupně usazuje na dně a stěnách láhve a roztok CCl₄ se postupně čeří. Pokud tomu tak není, přidáme dalších 10 ml etanolu a necháme ho stát další den.
4/ CCl₄ opatrně slejeme a precipitát OsO₂ odmyjeme ze stěn láhve několika 20 ml dávkami acetonu.
5/ Sraženinu odfiltrujeme a promyjeme asi 50 ml acetonu. Vysušíme v sušičce, kde na vázání vodní páry můžeme použít vysušený K₂SO₄.
6/ 1 g OsO₂ nasypeme do 50 ml suché odměrky a přidáme 45 ml redestilované vody. Po rozpuštění přidáme k roztoku 1 ml peroxidu vodíku a promícháme. Uzavřenou nádobu necháme stát 30 min v lednici a opět přidáme 1 ml peroxidu vodíku a vrátíme na 20 min do lednice.Postupně dochází k oxidaci OsO₂ na OsO₄.
7/ Výsledný roztok doplníme redestilovanou vodou na 50 ml a máme připravený 4% zásobní roztok k fixačním účelům.

Zpět

Protokol č.6 - Příprava 0,1 M fosfátového pufru

Potřebné roztoky: A - 0,2 M Na₂HPO₄. Můžeme jej připravit rozpuštěním daného množství následujících sloučenin v 1000 ml vody:
Na₂HPO₄.2H₂O - 35,61 g
Na₂HPO₄.7H₂O - 53,65 g
Na₂HPO₄.12H₂O - 71,46 g
B - 0,2 M NaH₂PO₄. Připravíme opět rozpuštěním daného množství soli v 1000 ml vody.
NaH₂PO₄.H₂O - 27,6 g
NaH₂PO₄.2H₂O - 31,21 g
Postup:
Fosfátový pufr požadované hodnoty získámě smícháním obou roztoků v příslušném poměru podle následující tabulky {tab.1} a doplněním na objem 100 ml redestilovanou vodou. Tabulka platí pro teplotu roztoku 25⁰ a osmolalita výsledného roztoku je 226 mOs.

Tab.1 - pH fosfátového pufru
Požadované pH	Roztok A	Roztok B
6,0	6,15	43,85
6,2	9,25	40,75
6,4	13,25	36,75
6,6	18,75	31,25
6,8	24,5	25,5
7,0	30,5	19,5
7,2	36,0	14,0
7,4	40,5	9,5
7,6	43,5	6,5
7,8	45,75	4,25

Tab.1a - Příprava GA fixace s fosfátovým pufrem

25% GA (ml)	4	6	8	10	12
0,2 M fosfátový pufr (ml)	50	50	50	50	50
redest.voda doplnit do (ml)	100	100	100	100	100
konečná kond. GA (%)	1	1,5	2	2,5	3

Zpět

Protokol č.7 - Příprava 0,2 M kakodylanového pufru

Potřebné roztoky: A - O,2 M roztok kakodylanu sodného[Na(CH₃)₂AsO₂.3H₂O] připravíme rozpuštěním 42,8 g v 1000ml redestilované vody.
B - 0,2 M HCl získáme rozpuštěním 1,66 ml konc. HCl v 100 ml vody.
Postup:
Pufr o požadovaném pH získáme přidáním roztoku B do 50 ml roztoku A v poměru podle {tab.2} a doplněním vodou na objem 200 ml.

Tab.2 - pH kakodylanového pufru
Požadované pH	Roztok B (ml)	Požadované pH	Roztok B (ml)
6,4	18,3	7,0	6,3
6,6	13,3	7,2	4,2
6,8	9,3	7,4	2,7

Tab.2a - Příprava GA fixace s kakodylátovým pufrem

25% GA (ml)	4	6	8	10	12
0,2 M kakodylanový pufr (ml)	50	50	50	50	50
redest.voda doplnit do (ml)	100	100	100	100	100
konečná kond. GA (%)	1	1,5	2	2,5	3

Zpět

Protokol č.8 - Dehydratace a infiltrace pomocí Durcupanu ACM

Postup:
50% (objem.) roztok Durcupanu ACM v destil vodě: doba setrvání preparátu 15-30 min
70% (objem.) roztok Durcupanu ACM v destil vodě: doba setrvání preparátu 15-30 min
90% (objem.) roztok Durcupanu ACM v destil vodě: doba setrvání preparátu 15-30 min
čistý Durcupan ACM: doba setrvání preparátu 2 x 30 - 60 min
prosycení směsí Durcupan ACM/epoxid. pryskyřice v poměru 3:1 (objem.): doba setrvání preparátu 60 min
prosycení směsí Durcupan ACM/epoxid. pryskyřice v poměru 1:1 (objem.): doba setrvání preparátu 60 min
prosycení směsí Durcupan ACM/epoxid. pryskyřice v poměru 1:3 (objem.): doba setrvání preparátu 60 min
čistá epoxidová pryskyřice doba: setrvání preparátu 2 x 1-2 hod nebo přes noc
polymerizace při 60⁰ C 24-72 hod
Současná dehydratace a infiltrace pomocí vodourozpustného Durcupanu ACM se provádí při pokojové teplotě za pomalého promíchávání.

Zpět

Protokol č.9 - Příprava roztoku toluidinové modři pro barvení polotenkých řezů

Barvící roztok: 1% roztok tetraboritanu sodného a 1% roztok toluidinové modře smícháme v poměru 1 : 1
Postup:
Polotenké řezy barvíme na podložním skle ohřátém na histochemické polýnce na tepoltu 70 - 90⁰ C po dobu 10- 30 s. Potom řezy opláchneme proudem destilované vody ze střičky a zkontrolujeme intenzitu zbarvení.

Zpět

Protokol č. 10 - příprava nasyceného roztoku octanu uranylu ( dále UA )

Potřebné chemikálie: uranylacetát, etanol (absolut.)
Postup:
1/ navážíme 2,6g UA a zalejeme jej 20ml 50% etanolu
2/ roztok mícháme 2 hod. na magnetickém míchadle
3/ roztok 3x přefiltrujeme přes stejný filtrační papír nejlépe v lednici
4/ necháme před použitím stát do druhého dne v lednici
Vzhledem k jeho citlivosti na světlo skladujeme připravený roztok v tmavé lahvičce při 4°C.

Postup kontrastování:
1) - pracujeme v tmavé krabičce (např. obalené hliníkovou fólií)
- kapky roztoku UA naneseme stříkačkou s jednorázovým filtrem (0,45 µm) podle počtu sítěk na parafilm nebo dentální vosk umístěný na dně krabičky
- vytvoříme etanolovou atmosféru nakápnutím konc. etanolu na buničinu
- síťky položíme na kapky řezama dolů na 30 min.
2) - kontrastovací činidlo odstraníme propláchnutím sítěk např. ve třech Petriho miskách s 30% etanolem, síťky po každém kroku osušíme přitisknutím na filtrační papír

Zpět

Protokol č. 11 - příprava kontrastovacího roztoku citrátu olovnatého ( dále LC )

Potřebné chemikálie: citrát olova, hydroxid sodný, čerstvě převařená destilovaná voda (kvůli snížení obsahu oxidu uhličitého)
Postup:
1/ navážíme 0,02-0,04 g LC a zalejeme jej 20ml převařené dest. vody
2/ přidáme 0,2ml 10N NaOH (získáme jej rozpuštěním 40g NaOH ve 100ml vody)
3/ po úplném rozpuštění uchováváme roztok v tmavé lahvičce při 4°C
4/ před použitím odebereme potřebné množství injekční stříkačkou z oblasti těsně pod hladinou a roztok centrifugujeme při 10000-15000ot/min deste minut.
Pokud se objeví bílý zákal na dně, roztok je nepoužitelný. V lednici vydrží zhruba 3 týdny

Postup kontrastování:
1) - mikropipetou o objemu 20ml naneseme kapky podle počtu sítěk na parafilm nebo dentální vosk umístěný na dně Petriho misky
- kolem vosku nasypeme pecičky NaOH, které zakápneme vodou (snížíme obsah oxidu uhličitého v Petriho misce)
- sítˇky položíme na kapky řezama dolů na 20 min.
2) - zbytek kontrastovacího činidla důkladně opláchneme ze sítěk v Petriho miskách s redest. vodou
- sítˇky po každém máchání usušíme přitisknutím na filtrační papír
Sítˇky při přenášení držíme kapilární pinzetou za jejich silnější okraj. Pracujeme rychle s malým množstvím sítěk (maximálně 10)

Zpět

Desing by NebeNet