Obsah:
Trocha historie...
Proč elektrony?| Mikrovlny Mikrovlny patří do široké rodiny elektromagnetických vlnění, zahrnující rovněž oblast viditelného světla, které se řídí Maxwellovými rovnicemi. Platí pro ně, že vektory charakterizující magnetické a elektrické pole jsou v každém bodě a v každém okamžiku k sobě kolmé a oba jsou kolmé ke směru pohybu vlny (obr. 1). Jejich amplitudy mají konstantní poměr a ve vakuu se elektromagnetické vlny pohybují rychlostí světla, takže platí vztah f . l = c kde f je vlnová frekvence, l je vlnová délka a c rychlost světla ve vakuu. Za mikrovlny je považováno elektromagnetické vlnění s frekvencí v intervalu 300 Mhz až 300 Ghz, což odpovídá délce vlny v rozsahu od 1 m do 1 mm. Většina frekvencí v tomto intervalu se používá ke komunikačním účelům a aby se zabránilo vzájemnému rušení, byla pro mikrovlnný ohřev určena frekvence 2,45 Mhz, která odpovídá délce vlny 12,2 cm. Mikrovlny se můžou šířit v různých médiích, samozřejmě s nižší rychlostí než ve vakuu. Ve vzduchu je tento rozdíl malý, jiná je situace ve vodě, kde se mikrovlny šíří 9 krát nižší rychlostí, a v důsledku toho se i vlnová délka devětkrát zkrátí na 1,36 cm. Při přechodu mikrovln z jednoho prostředí do druhého dochází na rozhraní k odrazovým a lomovým jevům stejně jako u světla a platí pro ně stejné zákony. V podstatě jde o kombinaci tří případů - mikrovlny se odrazí, absorbují nebo projdou (obr. 2). Při absorpci mikrovln v materiálu se snižuje amplituda vlny. Míra absorpce je charakterizována pomocí penetrační hloubky, což je vzdálenost, kterou mikrovlnné záření v materiálu musí projít, aby jeho intenzita klesla na 13,53 % původní hodnoty. Jak vyplývá z tab. I u kovových materiálů, které jsou dobře vodivé, se penetrační hloubka pohybuje řádově v mm a mikrovlny se z jejich povrchu odrážejí, zatímco led a obecně nevodiče jsou pro mikrovlny transparentní. U ostatních materiálů závisí penetrační hloubka na jejich dielektrických vlastnostech, charakterizovaných relativní permitivitou. K zajímavému jevu dochází při dopadu mikrovln na zakřivené rozhraní vzduch - voda, které je schopné fokusovat mikrovlny (obr. 3). Je to důsledek vysokého indexu lomu, kdy se mikrovlny po vstupu do vodného prostředí lámou ke kolmici. Výsledkem jsou problémy s ohřevem vodných objektů tvaru koule ( vajíčka, rajčata, brambory), u kterých dochází k přehřátí středu objektu a jeho následné explozi. Na závěr obecného úvodu o vlastnostech mikrovln zbývá vysvětlit, proč jsou vlastně mikrovlny schopné ohřívat. Pokud použijeme k popisu mikrovln de Broglieho vztah, zjistíme, že na ně lze pohlížet také jako na částice s energií 0,00001 eV, což je energie velmi malá a nestačí ani k rozbití nejslabší chemické vazby. Odtud tedy schopnost mikrovln ohřívat neplyne. Pro ohřev se využívá jevu, kdy permanentní dipóly se v stejnosměrném elektrickém poli orientují do energeticky nejpřijatelnější polohy (obr. 4). Pokud dojde k přeplování pole , snaží se molekuly nesoucí náboj opět otočit do nejvhodnější pozice. Snaha vyrovnat se s měnícím se elektrickým polem mikrovln vede k rotačnímu pohybu, při němž dochází ke kolizím a tření se sousedními molekulami a ke vzniku tepla. Nejběžnější molekulou, jejíž permanentní dipólový moment vede k její rotaci při ozařování mikrovlnami je voda, která je zároveň ve značném množství přítomna v biologických materiálech a způsobuje tak jejich ohřev v mikrovlnné troubě. Přehled dipólových momentů nejběžnějších chemikálií používaných při přípravě preparátů uvádí tab. II. Mikrovlnná trouba Místem, kde dochází k ozáření preparátu mikrovlnami a v důsledku toho k jeho ohřátí je mikrovlnná trouba. Jedná se o prostor ohraničený kovovými stěnami, v němž se šíří mikrovlny (obr. 5). Ty produkuje magnetotron, z něhož jsou vlnovodem vedeny do vnitřního prostoru trouby. Při svém šíření prostorem trouby se mikrovlny odráží od stěn a skládají se. Výsledkem je vznik míst s vyšší a nižší intenzitou záření v závislosti na geometrických parametrech vnitřního prostoru. Nebezpečným je vznik stojatého vlnění, pokud je mikrovlnná trouba zapnuta bez zátěže, kdy oproti místům s nulovou intenzitou mohou vzniknout místa s několikanásobnou intenzitou a rázy, které mohou mikrovlnnou troubu poškodit. Aby se minimalizovaly tyto jevy vedoucí k nerovnoměrnému ohřevu, je většina přístrojů vybavena míchadlem mikrovln buď v podobě otáčející se kovové tyče nebo otočného talíře. Samozřejmě, ke změnám v geometrických parametrech dochází, kdykoliv do mikrovlnné trouby umístíme nějakou nádobu s látkou, kterou chceme ohřát. O nerovnoměrnosti ohřevu v důsledku existence horkých a studených bodů svědčí rozložení teplot v jedné z horizontálních rovin uvnitř trouby na (obr. 6), jak je zaznamenal a publikoval Wickersheim a kol v r.1990. Pro reprodukovatelnost ohřevu je třeba při umisťování vzorků do mikrovlnky přesně zaznamenávat jeho polohu: např. pomocí vzdálenosti od středu otočného talíře nebo pomocí sítě narýsované na průhledné fólii v případě trouby bez otočného talíře. Ke standardní výbavě běžných mikrovlnných trub patří časový spínač a nastavení výkonu magnetotronu. Pro použití trouby k laboratorním účelů je vhodný nejlépe digitální časový spínač, který umožňuje i nastavení velmi krátkých časů. U kuchyňských mikrovlnek magnetotron pracuje stále v plném výkonu a jeho snížení se dociluje periodickým vypínáním. Jedna perioda se označuje jako čas cyklu. Je zřejmé, že pro účely přípravy preparátů je nejvýhodnější co nejkratší čas cyklu, který umožňuje jemné nastavení výkonu. Z bezpečnostních důvodů jsou dvířka mikrovlnné trouby opatřena vypínačem, který automaticky vypne magnetotron, dojde-li k jejich otevření za chodu trouby. Základním problémem při použití běžné mikrovlnné trouby při přípravě preparátů pro TEM a SEM je určení teploty ve vzorku. Použití konvenčních teploměrů je nebezpečné, protože mohou v troubě explodovat a navíc mikroskopický vzorek je mnohem menší. U termočlánků dochází k zahřívání povrchové vrstvy hrotu a termočlánek pak neměří skutečnou teplotu ve vzorku, ale na povrchu hrotu. Drahou, leč poměrně velmi přesnou metodou, kterou bývají vybaveny profesionální mikrovlnné trouby určené do laboratoří, je měření teploty pomocí krystalu z galium-arsenidu a optického vlákna. Krystal je schopen emitovat charakteristické spektrum v závislosti na teplotě a optické vlákno přenese toto spektrum do zapisovače. Protože jsou oba materiály pro mikrovlny transparentní, mohou měřit skutečnou teplotu tam, kde jsou umístěny. Přesnost tohoto způsobu měření se pohybuje kolem 100 C. Orientačně se můžeme přesvědčit o nárůstu teploty při mikrovlnování preparátu pomocí např. barviva zalitého do želatiny, které má schopnost na změnu teploty reagovat změnou barvy. Místo se vzorkem provedeme nejdříve pokus s kouskem želatiny za jinak naprosto stejných podmínek. Pokud kousek želatiny změní barvu, víme, jaké teplotě bude vzorek v mikrovlnné troubě vystaven. Zaznamenáme-li teplotu v ohřívaném objemu v závislosti na čase získáme teplotní křivku. Její průběh ovlivňují parametry teploměru (přesnost, typ, umístění), parametry ohřívaného vzorku (objem, tvar, umístění v mikrovlnce, chemické složení) a parametry přístroje (nastavený výkon, čas cyklu, možnosti tepelné regulace). Ideální případ teplotní křivky je znázorněn na (obr. 7), kdy teplota rychle vzroste na předem stanovenou hodnotu a dále je již konstantní. Praktické použití Při přípravě biologických vzorků pro TEM a SEM se mikrovlnná trouba používá k urychlení a zkvalitnění všech kroků přípravy. Obecně při ozáření připravovaného vzorku mikrovlnami dojde ke vzrůstu jeho teploty a ke zlepšení penetrace roztoku, ve kterém je vzorek umístěn, do jeho vnitřku. V současné době lze v literatuře najít velké množství postupů, zabývajících se časem ozařování pro jednotlivé typy vzorků, teplotou a složením fixačních roztoků, velikostí vzorků atd. K nejlepším patří Mikrovlnná kuchařka pro mikroskopiky, napsaná v roce 1992 Kokem a Boonem, kniha Logina a Dvoraka z roku 1996 a nejnověji kniha Mikrovlnné techniky a protokoly editované Gibersonem a Demaree vydaná v roce 2001. Nejčastěji se mikrovlny používají v prvním kroku přípravy, kterou je fixace. Na ní především závisí úsilí o maximální věrnost preparátu nativnímu stavu. Někdy, v případech rychlé diagnostiky nebo speciálních postupů pro imunoznačení, mohou samotné mikrovlny nahradit fixační činidlo, pak se hovoří o mikrovlnné stabilizaci. V případě, že se do mikrovlnné trouby umístí vzorek ve fixačním roztoku, obsahujícím např. glutaraldehyd, jde o mikrovlnnou fixaci, kdy samotným fixačním činidlem zůstává glutaraldehyd a mikrovlnné ozáření stimuluje jeho penetrační rychlost. Vlastní uspořádání při ozařování vychází z charakteru preparátu a typu přístroje. Na (obr. 8) jsou zobrazeny dva možné způsoby, kdy v případě A půjde určitě o mnohem intenzivnější ohřev, v uspořádání B máme větší jistotu, že vzorek neuvaříme. Vzrůst teploty u homogenního vzorku je ovlivněn řadou faktorů: - parametry mikrovlnné trouby. Nejdůležitějším parametrem je nastavený výkon, přičemž platí, že čím vyšší výkon, tím teplotní křivka vykazuje větší skoky a ohřev je nerovnoměrnější (obr. 9). - parametry zátěže, především její hmotnost a rozměry. Obecně platí, že s rostoucí hmotou roste i čas potřebný k ohřevu, Zvětší-li se hmotnost dvakrát, i čas potřebný k ohřátí zátěže na stejnou teplotu se dvakrát prodlouží (obr. 10). - tepelné vlastnosti zátěže. Například 100 ml vody potřebuje 2,2 krát více energie na zahřátí k varu než 100 ml alkoholu. Do jaké míry i nepatrné ozáření vzorku při fixaci může zlepšit výslednou ultrastrukturu preparátu dokládají fotografie na (obr. 11),(obr. 12) a (obr. 13). Jsou na nich zachyceny myší hepatocyty, připravené dvoustupňovou fixací GA a oxidem osmičelým, odvodněné acetonem a zalité do Durcupanu. Ultratenké řezy byly kontrastované roztoky Pb a U. Jejich příprava se liší ve fázi fixace, kdy vzorek na (obr. 12) byl ozařován v výše zmíněném uspořádání B 3 krát 30s při nejnižším výkonu mikrovlnné trouby Miele, vzorek na (obr. 13) byl během fixace ohřátý na vodní lázni na teplotu 400 C. |
 Předchozí |
Další  |
 Literatura | |
Obrázky | |
 |
Obr.1 - elektromagnetická vlna |
| Zpět | |
 |
Obr.2 - Mikrovlny a jejich interakce s různými typy materiálu |
| Zpět | |
 |
Obr.3 - fokusační vliv koule naplněné vodou (např.rajče) na procházející mikrovlny |
| Zpět | |
 |
Obr.4 - princip mikrovlnného ohřevu |
| Zpět | |
 |
Obr.5 - schema mikrovlnné trouby |
| Zpět | |
 |
Obr.6 - rozložení teplot v průřezu mikrovlnnou troubou (Wickersheim a kol v r.1990) |
| Zpět | |
 |
Obr.7 - ideální teplotní křivka pro elektronmikroskopické účely |
| Zpět | |
 |
Obr.8 - dvě z možných uspořádání při ohřevu elektronmikroskopických vzorků |
| Zpět | |
 |
Obr.9 - vliv nastaveného výkonu trouby na růst teploty v 50 ml vody (Kok a Boon, 1992) |
| Zpět | |
 |
Obr.10 - A- teplotní křivky naměřené při ohřevu různých objemů vody, při jinak identických podmínkách, B- teplotní křivky naměřené při ohřevu různě velikých kapek vody, teplota dosáhne určitého maxima a dále se nezvyšuje, protože se dostane do rovnováhy ohřev s ochlazováním způsobený výpařováním z povrchu kapek (Kok a Boon, 1992) |
| Zpět | |
 |
Obr.11 - myší hepatocyt připravený běžným postupem - dvoustupňová fixace GA a OsO4, dehydratace acetonovou řadou, zalití do Durcupanu, kontrastování solemi Pb a U, prohlíženo v TEM JEOL 100 B |
| Zpět | |
 |
Obr.12 - myší hepatocyt, připravený stejně jako v předchozím případě, pouze vzorek při fixaci 3 krát mikrovlnovánu 30 s v upořádání B v Mikrovlnné troubě Miele při výkonu 80 W |
| Zpět | |
 |
Obr.13 -myší hepatocyt, připravený stejně jako v případě obr.11, vzorek však v průběhu fixace byl ohřátý na vodní lázni nna teplotu 400 C |
| Zpět | |
Tabulky | ||||||
| Tab.1 - Penetrační hloubka mikrovln v různých materiálech (Kok a Boon, 1992) | ||||||
| Látka | Teplota (0C) |
penetrační hloubka (cm) |
Látka | Teplota (0C) |
penetrační hloubka (cm) | |
| Voda | 1.5 | 1.7 | Voda | 25 | 3.4 | |
| Voda | 45 | 5.4 | Voda | 65 | 7.6 | |
| Voda | 95 | 14 | Roztok NaCl 0.1M |
25 | 2 | |
| Roztok NaCl 0.3M |
25 | 1 | Roztok NaCl 0.5M |
25 | 0.7 | |
| Led | -12 | 3000 | Měď | 25 | 0,000013 | |
| Hliník | 25 | 0,000017 | Teflon | 20 | 9000 | |
| Sval | 37 | 2 | Játra | 37 | 2,1 | |
| Plíce | 37 | 2,5 | Slezina | 37 | 1,8 | |
| Šedá hmota mozková | 37 | 2,5 | Krev | 37 | 2 | |
| kostní dřeň | 37 | 10 | Kost | 37 | 12 | |
| Tuk | 37 | 6 | Metanol | 25 | 1,5 | |
| Etanol | 25 | 7 | n-Butanol | 25 | 5 | |
| Máslo | 20 | 14 | Olivový olej | 20 | 40 | |
| Etylenglykol | 25 | 1,3 | Nylon | 20 | 300 | |
| Zpět | ||||||
| Tab.2 - Dipólový moment pro různé látky v plynném stavu (Kok a Bonn, 1992) | |||
| Látka | µ (10-30 Cm) | Látka | µ (10-30 Cm) |
| Voda | 6,17 | Metan | 0 |
| CH3Cl | 6.24 | CHCl3 | 3.37 |
| Metanol | 5.7 | Etanol | 5.64 |
| Isopropanol | 5.54 | Aceton | 9.61 |
| Peroxid vodíku | 7,34 | Oxid osmičelý | 0 |
| Formaldehyd | 7,77 | Ovalbumin | 830 |
| Zpět | |||